عالية الدقة التحليل الكمي Immunogold من غشاء المستقبلات في الشبكية نقاط الاشتباك العصبي الشريط

الهدف العام من هذه التجربة هو تطوير نهج جديد لتحليل بروتينات الغشاء في نقاط الاشتباك العصبي في الشبكية من الناحية الكمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا العصبية للشبكية مثل الموقع الدقيق للبروتينات في نقاط الاشتباك العصبي داخل الدائرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن تقدير عدد وكثافة وسرعة البروتينات المتعددة في نقاط الاشتباك العصبي الشريطية للشبكية.

لتوضيح إجراء استبدال التجميد والتقسيم الرقيق للغاية ، لدينا المستندات رون بتراليا ويا شيان وانغ من NIDCD Advanced Imaging Core. لبدء هذا الإجراء ، قم بتشريح مقلة العين تحت المجهر. للقيام بذلك ، قم أولا بإزالة القرنية.

ثم قم بإزالة العدسة والجسم الزجاجي من السطح بين الشبكية باستخدام الملقط. بعد ذلك ، قشر الصلبة حتى يتم عزل شبكية العين عن كوب العين. قطع شبكية العين على الفور إلى 100 200 شريط بسمك 200 ميكرومتر باستخدام ماكينة حلاقة.

بعد ذلك ، امزج شرائط شبكية العين في 4٪ بارافورمالدهيد في 0.1 مولار PB. ثم ، في 4٪ بارافورمالدهايد بالإضافة إلى 0.01٪ جلوتارالديهايد في درجة حرارة الغرفة. بعد عدة غسلات في PB ، مع 0.15 مللي مولار كلوريد الكالسيوم ، قم بالتبريد بحماية شرائط الشبكية بالجلسرين في 0.1 مولار PB ، قبل استبدال التجميد. قبل وضع الأنسجة المجمدة في حوامل التضمين المسطحة ، قم بقص دائرة رفيعة من لوح بلاستيكي شفاف وضعها في الجزء السفلي من كل حامل للسماح بإزالة صندوق العينات المبلمرة بسهولة عند الانتهاء.

الآن ، قم بتعيين التسلسل التلقائي في AFS. املأ AFS بالنيتروجين السائل وضع حوامل التضمين المسطحة في AFS. املأها ب 1.5٪ أسيتات اليورانيل في الميثانول وقم بتبريدها مسبقا.

لتجميد شرائط الشبكية في البروبان السائل عند 184 درجة مئوية ، استخدم فرشاة دقيقة لوضع العينات على قطع صغيرة من الشريط اللاصق المزدوج المرفقة ببذرة معدنية في نهاية قضبان الغاطس. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت الإضافي باستخدام الفرشاة. اغمر القضبان في البروبان السائل لمدة خمس ثوان تقريبا.

ثم انقلها إلى AFS باستخدام غرفة نقل صغيرة مملوءة بالنيتروجين السائل. بعد وضع العينة والأدوات المجمدة والملقط والمشرط في AFS ، قم بتبريد الأدوات في الغرفة لعدة دقائق قبل لمس الأنسجة. أو قم بتبريدها عن طريق وضع أطراف الأدوات لبضع ثوان في غرفة النقل الصغيرة المملوءة بالنيتروجين السائل.

بعد ذلك ، قم بإزالة العينة والشريط من كعب الروتين باستخدام مشرط ناعم. بعد ذلك ، ضع قطعتين من الأقسام المجمدة في كل من الآبار السبعة في حامل الألمنيوم المسطح مع 1.5٪ أسيتات اليورانيل في الميثانول. احتفظ بها عند 90 درجة مئوية لمدة 32 ساعة على الأقل في AFS.

ثم قم بزيادة درجة الحرارة تدريجيا إلى 45 درجة مئوية في التسلسل التلقائي. بعد ذلك ، اغسل العينات ثلاث مرات في الميثانول المبرد مسبقا. بعد ذلك ، تسلل العينات تدريجيا باستخدام راتنجات التضمين ذات درجة الحرارة المنخفضة كوسيط تضمين.

في اليوم التالي ، قم بتغيير الراتنج مرة أخرى واضبط مستوى الراتنج للوصول إلى الحافة العلوية للآبار. قم بإعداد ضوء الأشعة فوق البنفسجية على AFS وبلمرة العينات بضوء الأشعة فوق البنفسجية في AFS حتى نهاية التسلسل التلقائي. ثم قم بإزالة العينات من AFS.

عادة ما تظل كتل العينة تظهر بعض اللون الوردي واللون. ضع العينات بالقرب من ضوء الفلورسنت في غطاء الدخان الكيميائي في درجة حرارة الغرفة طوال الليل ، أو حتى تظهر صافية تماما. في هذه الخطوة ، قم بقص 70 قسما رفيعا جدا بسماكة غير مترا باستخدام ميكروتوم فائق الصغر ، واجمعها على شبكات النيكل المطلية بالكربون formvar.

اغسل الشبكات بالماء المقطر مرة واحدة ، متبوعة بثلاث غسلات من TBS. بعد ذلك ، قم باحتضان الشبكات في 20 ميكرولترا من 5٪ BSA في TBS لمدة 30 دقيقة ، ثم في 20 ميكرولترا من خليط يحتوي على الماعز المضاد ل CTB وجسم مضاد لوحدة فرعية NMDAR واحدة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الشبكات ثلاث مرات باستخدام 20 ميكرولتر من TBS في كل مرة عند درجة الحموضة 7.6.

، اغسل الشبكات مرة واحدة باستخدام TBS عند درجة الحموضة 8.2 لمدة خمس دقائق. احتضان الشبكات لمدة ساعتين ب 20 ميكرولترا من خليط يحتوي على حمار مضاد للأرانب IGG مقترن بجزيئات ذهب 10 نانومتر ، وحمار IGG مضاد للماعز مقترن بجزيئات ذهب 18 نانومتر. بعد ساعتين ، اغسل الشبكات في 20 ميكرولترا من TBS ، عند درجة الحموضة 7.6 ثلاث مرات ، متبوعا بغسل في الماء فائق النقاء ثم جفف الشبكات بالهواء.

بعد ذلك ، قم بتلطيخ الشبكات بنسبة 5٪ من أسيتات اليورانيل في الماء المقطر لمدة ثماني دقائق ، متبوعا بنسبة 0.3٪ سترات الرصاص في الماء المقطر لمدة خمس دقائق في الظلام. بالنسبة لتجارب الملصقات الثلاثية ، احتضن الشبكات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع 20 ميكرولترا من خليط من CTB المضاد للماعز ، ومضاد للفأر PSD-95 ، ومضاد للأرانب UN2A. بعد ذلك ، احتضان الشبكات لمدة ساعتين باستخدام 20 ميكرولترا من خليط من IGGs مقترنا بجزيئات ذهب 18 و 10 وخمسة نانومتر.

في هذا القسم، قم أولا بتعيين شريط المقياس. ثم قم بقياس طول PSD لتشعبات RGC الفردية باستخدام برنامج ImageJ. بعد ذلك ، احسب جزيئات الذهب في حدود 10 نانومتر من الغشاء بناء على متوسط سمك يتراوح من سبعة إلى تسعة نانومتر لغشاء البلازما.

احسب كثافة الجسيمات كعدد جزيئات الذهب لكل ميكرومتر خطي. بعد ذلك ، قم بقياس المسافة بين مركز كل جسيم ذهبي ومنتصف PSD للموقع المشبكي ، أو حافة PSD ، للموقع خارج المشبكي. تظهر هذه الصورة وضع العلامات المناعية المزدوجة ل GluA2 / 3 و CTB.

هذا هو الشريط قبل التشابك وتتجمع جزيئات الذهب الصغيرة في PSD لعمليات RGC. تظهر هذه الصورة وضع العلامات المزدوجة على الذهب المناعي ل GluN2B و CTB. توجد جزيئات الذهب الصغيرة على غشاء البلازما خارج المشبكي.

وتظهر هذه الصورة الملصقات الذهبية المناعية المزدوجة ل GluN2A و CTB. على غرار GluA2 / 3 ، تتجمع الجسيمات الصغيرة داخل PSD. يظهر هنا وضع العلامات المناعية الثلاثية ل GluN2A و PSD-95 و CTB.

يتم توطين جزيئات الذهب GluN2A وجسيمات الذهب PSD-95 بشكل مشترك داخل PSD على تشعبات RGC الفردية الإيجابية ل CTB. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إصلاح الأنسجة برفق شديد ، لأن بعض مضادات البروتين ، مثل مستقبلات NMDA تنخفض بشكل ملحوظ مع التثبيت القوي المطول. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف وتحليل بروتينات الغشاء بدقة كبيرة في نقاط الاشتباك العصبي الشريطية للشبكية.