بوساطة فج تسليم المستهدف الحمض الريبي النووي الذواب يبني لاسقاط التعبير الجيني في

الهدف العام من هذا الإجراء هو القضاء على الجينات ذات الأهمية في عدد متزايد من الإشريكية القولونية. غالبا ما تستخدم الضربات القاضية الجينية لاستكشاف الأسئلة الأساسية لوظيفة الجينات. قد يكون لهذه الأساليب أيضا تطبيق في البيولوجيا التركيبية.

على سبيل المثال ، في إسكات الجينات غير المرغوب فيها مثل عوامل الضراوة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراؤها في مزارع دفعات الإشريكية القولونية دون تعديل وراثي مسبق ، مع نتائج يمكن ملاحظتها بعد بضع ساعات فقط. للبدء ، باستخدام بلازميد يحتوي على شريط تعبير sRNA مصمم وفقا لبروتوكول النص ، قم بإجراء طفرات موجهة للموقع على التسلسل عن طريق تحديد تسلسل دليل 24 زوجا أساسيا أولا في كاسيت التعبير.

تصميم وتوليف بادئات أمامية وخلفية مع مناطق قصيرة من التماثل مع كاسيت sRNA الحالي ، ويحيط بتسلسل الدليل الجديد المكون من 24 زوجا أساسيا. إعداد مزرعة خمسة ملليلتر من الإشريكية القولونية في LB والمضادات الحيوية التي تحمل قالب تعبير الحمض النووي الريبي phagemid. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الرج.

بعد استخراج وتنقية قالب sRNA phagemid من الثقافة ، قم بإعداد تفاعلين تفاعلي تفاعل البوليميراز المتسلسل ، باستخدام 10 إلى 50 ضعف الكمية الموصى بها من قالب الحمض النووي ل sRNA phagemid والبوليميراز عالي الدقة. قم بإعداد رد فعل واحد مع الأمام والآخر مع التمهيدي العكسي. بعد استخدام شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية لتشغيل التفاعلات ، اجمع بين التفاعلين في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

ثم قم بتلدين المنتجات عن طريق التسخين إلى 98 درجة مئوية في حمام مائي مغلي. قم بإيقاف تشغيل مصدر الحرارة على الفور واترك الحمام يعود ببطء إلى درجة حرارة الغرفة خلال الساعة إلى الساعتين التاليتين. للتخلص من قالب sRNA غير المتحور ، أضف ميكرولتر واحدا من إنزيم تقييد DpnI إلى الخليط ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، أو للوقت الموصى به من قبل الشركة المصنعة للهضم الكامل.

بعد ذلك ، قم بتحويل خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا باستخدام واحد إلى خمسة ميكرولتر من منتج PCR الملدن. ثم عزل المستعمرات المفردة عن طريق الطلاء الانتقائي على ألواح LB بالمضادات الحيوية. للتحقق من دمج تسلسل الدليل الصحيح مع مستعمرة PCR.

استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لجمع كمية صغيرة من الخلايا من مستعمرة واحدة محولة. أضف الخلايا المجمعة إلى 50 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز في أنبوب طرد مركزي دقيق واخلطها عن طريق سحب العينات. ثم باستخدام جهاز تدوير حراري على الطاولة ، أو حمام مائي مغلي ، قم بتحلل الخلايا عن طريق التسخين إلى 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

باستخدام ميكرولتر واحد من الخلايا المحللة كقالب الحمض النووي ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا للشروط الموضحة هنا. بعد التحقق من تسلسل الدليل الصحيح ، قم بتلقيح مزرعة خمسة ملليلتر باستخدام استنساخ sRNA الصحيح ، وقم بتنمية الخلايا بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإعداد مخزون الجلسرين عن طريق الجمع بين 750 ميكرولتر من الثقافة الليلية مع 250 ميكرولتر من 60٪ من الجلسرين في أنبوب التبريد اللولبي.

لتحضير مخزونات phagemid المعبأة في M13 ، قم بإعداد ثقافة خمسة ملليلتر بين عشية وضحاها من الإشريكية القولونية ، تحمل تعبير الحمض النووي الريبي phagemid. أيضا ، قم بإعداد ثقافة خمسة ملليلتر بين عشية وضحاها من الإشريكية القولونية ، تحمل البلازميد المساعد M13KO7. في اليوم التالي ، بعد تنقية الحمض النووي ، قم بتحويل الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا باستخدام ميكرولتر واحد لكل من تعبير الحمض النووي الريبي phagemid والبلازميد المساعد.

لوحة على LB-agar مع المضادات الحيوية للاختيار لكلا البناء. تعبير Phagemid هو عبء لياقة بدنية كبير للخلايا وقد يؤدي إلى انخفاض كفاءة التحول. قد يكون من الضروري إدخال البلازميد في خطوتين متتاليتين للتحويل.

بعد احتضان الخلايا المحولة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، قم بإعداد مزرعة 10 ملليلتر من مستعمرة واحدة من السلالة المتحولة المشتركة. في صباح اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 3300 × جم لمدة 10 دقائق. اجمع المادة الطافية وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرون.

قم بتخزين مرشح phagemid المعبأ عند أربع درجات مئوية. بعد تحضير الخلايا المستهدفة F + ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة في مزرعة خمسة ملليلتر من وسط LB بالمضادات الحيوية ، وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز. في اليوم التالي ، استخدم خمسة ملليلتر من وسط LB الانتقائي لتخفيف الخلايا المستهدفة F + من واحد إلى مائة ، واستمر في الحضانة.

استزراع الخلايا لمدة ساعتين تقريبا حتى يتم الحصول على OD600 من 0.3 ، مما يشير إلى نمو مرحلة السجل. يجب أن تكون الخلايا المستهدفة للإسكات في المرحلة الأسية عند التعبير عن صمت F pilus لعدوى phagemid فعالة. أضف نسبة إلى مائة من phagemids المعبأة M13 إلى الخلايا المستهدفة لتحقيق ما يقرب من 99٪ من العدوى من السكان المستهدفين.

اسمح للعدوى بالاستمرار عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 30 إلى 60 دقيقة. ثم قم بفحص النمط الظاهري لإسكات الحمض النووي الريبي حسب الرغبة. باتباع البروتوكول الموضح في هذا الفيديو ، كاسيت إسكات الحمض النووي الريبي للبلازميد pAB.

تم تغيير 001 للاستهداف إلى mKate2. يوضح هذا الشكل أن سلالة الإشريكية القولونية المصابة ب anti-mKate2 phagemid لم تظهر أي مضان mKate2 يمكن اكتشافه على الخلفية. ومع ذلك ، فقد عبرت هذه السلالة عن GFP ، مما يشير إلى امتصاص ناجح للفاجميد.

في هذه التجربة ، أصيبت سلالة بكتريا قولونية مع جين كلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز مدمج كروموسومية ، أو جين CAT ، ب phagemid يستهدف CAT ، وتم اختبار إسكات الحمض النووي الريبي لمقاومة الكلورامفينيكول. أظهرت الخلايا التي استهدف فيها phagemid التصوير المقطعي المحوسب انخفاضا في البقاء على قيد الحياة عند تركيزات منخفضة من الكلورامفينيكول ، وقتل ما يقرب من 99٪ بتركيزات أعلى. من ناحية أخرى ، كانت الخلايا غير المصابة ، أو الخلايا المصابة بالحمض النووي الريبي الذي أسكت mKate2 ، مقاومة للكلورامفينيكول في جميع التركيزات التي تم اختبارها.

كما هو موضح هنا ، فإن إضافة الأمبيسلين ، المستخدم لاختيار البكتيريا التي تحمل الفاجيميد فقط ، قللت من بقاء الكلورامفينيكول على قيد الحياة إلى مستويات لا يمكن اكتشافها. يمكن تغيير الجين المستهدف للحمض النووي الريبي وإنتاج الباجيميد المصاب في غضون خمسة أيام. لا تنس أن العمل مع العاثيات يمكن أن يكون خطيرا للغاية على التجارب الأخرى في المختبر ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل استخدام أدوات المختبر المخصصة ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء لتجنب التلوث غير المرغوب فيه.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم واستنساخ وإنتاج phagemids المصابة ، والتي تحمل الحمض النووي الريبي لإسقاط أي جين ذي أهمية في عدد متزايد من الإشريكية القولونية.