مجهرية Fluorescence ورقة الضوء لالتقاط الصور 4-الأبعاد من آثار تحوير إجهاد القص في قلب الزرد النامي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الميكانيكي للقلب التنموي ، مثل تعديل إجهاد القص على تربيق القلب عبر إشارات الشق باستخدام مجهر ورقة ضوئية 4D. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تضيء قسما رقيقا من العينة بمستوى خمسة ميكرون ، مما يؤدي إلى تقليل تبييض الصور وتلف الصورة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح لنا الخوارزمية الحسابية الخاصة بنا بإعادة بناء قلب سمكة الزرد النابض رباعي الأبعاد.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص أمراض القلب الخلقية لأنها تسمح بالتصور المتسلسل للترب القلبي في مرحلة النمو المبكرة وصولا إلى النمط الظاهري اللاحق. بشكل عام ، سيجد الأشخاص الجدد في هذه التقنية أنه من الصعب تخيل التفكير في ثلاثة أبعاد بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يستغرق إنشاء النظام ومواءمته بدقة وقتا.

للبدء ، افصل ذكر وأنثى سمك الزرد في أحواض التكاثر باستخدام مقسم. ثم ارفع الحاجز واترك ذكر وإناث سمك الزرد بالتكاثر. اجمع أجنة الزرد وحقن مورفولينو أوليجو في الجنين لتثبيط التربيكول.

بعد ذلك ، قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة واحد بالمائة عن طريق إضافة جرام واحد من الاغاروز إلى 100 مل من الماء المقطر وتسخينه حتى يذوب كل الاغاروز. اترك الاغاروز ليبرد ثم استخدم ماصة سعة 20 ميكرولتر لتحميل أنبوب بلاستيكي صغير بأحد الأجنة المحضرة والأغاروز. قم بتأمين الأنبوب على مرحلة المجهر واستخدم هدف عشرة ×.

اضبط الهدف باستخدام المقبض بحيث يكون الجزء العلوي من الجنين في بؤرة التركيز. التقط صورا لجنين السمكة بأكمله على مدار دورات ضربات قلبية متعددة باستخدام صفيحة خفيفة بسماكة خمسة ميكرون. اجمع 500 إطار xy مع وقت تعريض ضوئي يبلغ عشرة مللي ثانية.

بعد ذلك ، انقل المرحلة ميكرون واحد في الوصول z إلى طبقة جديدة وكرر إجراء التصوير. استمر في تخيل 500 إطار لكل مستوى z حتى يتم تصوير القلب بالكامل. بعد ذلك ، افتح برنامج معالجة الصور وابدأ في تكديس الصور في 3D.

لتحقيق ذلك ، انقر أولا فوق البيانات المفتوحة. هنا ، حدد جميع الصور التي سيتم تكديسها في 3D ثم حدد تحميل. ثم أضف حجم فوكسل 0.65 × 0.65 بمقدار ميكرون واحد وانقر فوق موافق.

يعد إدخال حجم الفوكسل الصحيح أمرا بالغ الأهمية للتحليل الدقيق للصور ثلاثية الأبعاد. الآن ، انقر فوق مربع العرض متعدد المستويات وتصور الصورة ثلاثية الأبعاد. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مربع tiff الشريحة الزرقاء ذات النقطة الواحدة ، وحدد العرض ، ثم انقر فوق volran.

في قائمة التحرير، حدد الخيارات، ثم قم بتحرير خريطة الألوان. اضبط اللون باستخدام المربعات ثم انقر فوق موافق. أثناء وجودك في برنامج معالجة الصور ، انقر فوق ملف ، وافتح بيانات السلاسل الزمنية.

حدد ملفات 3D التي تم إجراؤها للتو بالنقر فوق التحميل ، وأدخل نفس حجم voxel كما كان من قبل. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مربع tiff الشريحة الزرقاء ذات النقطة الواحدة، ثم حدد العرض متبوعا ب volran. الآن ، انقر فوق تحرير.

حدد الخيارات. ثم حدد تحرير خريطة الألوان. اضبط اللون باستخدام المربعات ثم انقر فوق موافق.

بعد ذلك ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق عنصر تحكم السلسلة الزمنية ، وانقر فوق صانع الأفلام ، واضغط على زر التشغيل لمشاهدة الفيلم. للإنهاء ، أضف اسم الملف وحجم الإطار ومعدل الإطارات والجودة التي تساوي واحدا ، وأدخل أحادي المنظار. ثم انقر فوق تطبيق.

أخيرا ، قم بتصدير الفيديو. تشارك القوى الميكانيكية الحيوية ، مثل إجهاد القص الديناميكي الدموي ، بشكل وثيق في تكوين القلب. هنا ، تم استخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية لتصور النتوءات التربيقية البارزة في تجويف البطين بعد 75 ساعة من الإخصاب.

في غضون 100 ساعة من الإخصاب ، يمكن رؤية شبكة تربيقية بوضوح. في الجنين المعالج بالحقن المجهري gata1aMO ، يتم تقليل تكون الدم واللزوجة بنسبة 90 بالمائة. أدى انخفاض اللزوجة إلى تخفيف إجهاد القص الديناميكي الدموي ، مما أدى إلى تأخر البدء وشبكة تربيقية أقل كثافة.

كان من الممكن استعادة هذا التأخير والكثافة في الشبكة التربيقية عن طريق تنظيم التعبير الجيني المرتبط بالشق ، وإنقاذ التكوين التربيقي في 75 ساعة بعد الإخصاب وفي 100 ساعة بعد الإخصاب. وبالتالي ، فإن gata1a morpholino oligonucleotides قللت من القوى الديناميكية الدموية مما يؤدي إلى تقليل تنظيم إشارات الشق ، في حين أن Nrg1-mRNA ينقذ الجينات المنظمة ذات الصلة بالشق ويعيد بدء التربيب. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تقنية التصوير هذه في غضون ساعتين تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تطور القلب لدراسة العوامل الموجودة في جين الشق ، المسؤولة عن التكوين السليم للتربيق في أسماك الزرد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على الصور باستخدام الفحص المجهري الانتقائي للإضاءة وإنشاء ملفات صور 4D. لا تنس أن العمل بالليزر يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء النظارات المناسبة ، أثناء هذا الإجراء.