إعادة تشكيل الأساسي الميتوزى المغازل في كروية مستحلب قطرات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة تشكيل الهياكل الشبيهة بالمغزل الانقسامي داخل الحبس الهندسي للماء في قطرات مستحلب الزيت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تجميع المغزل الانقسامي ، مثل كيفية وضع المغازل وتجميعها ، وما هي المساهمة المحددة للمكونات الفردية في هذه العمليات؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نستخدم نهجا من أسفل إلى أعلى لإعادة تكوين الهياكل الشبيهة بالمغزل داخل الحبس الهندسي الذي يحاكي شكل الخلية الانقسامية.

يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة العمليات الأخرى التي تعتمد على الحبس الخلوي. امزج 10 أجزاء من البوليمر المسبق PDMS مع جزء واحد من عامل المعالجة في كتلة إجمالية تبلغ حوالي 40 جراما. ثم ضع المزيج في غرفة مفرغة لمدة 30 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.

في هذه الأثناء ، لف ورق الألمنيوم حول القالب لإنشاء كوب بعمق سنتيمتر واحد بقطر أربع بوصات. عندما تصبح جاهزا ، اسكب حوالي 3/4 من مزيج PDMS في القالب. ثم أعد PDMS إلى غرفة مفرغة لمدة 30 دقيقة أخرى.

بعد التفريغ ، قم بمعالجة PDMS لمدة ساعة عند 100 درجة مئوية. في هذه الأثناء ، قم بإعداد بعض الشرائح الزجاجية لطلاء الدوران عن طريق غبارها بالهواء المضغوط. بعد ذلك ، قم بتدوير مزيج PDMS المتبقي على الشرائح.

عالج هذه الشرائح لمدة ساعة عند 100 درجة مئوية لتقوية PDMS. بعد ذلك ، قم بإزالة PDMS برفق باستخدام شفرة حلاقة ، وقم بعمل الثقوب المطلوبة من شرائط PDMS لصنع رقائق الموائع الدقيقة. الآن ، يعالج الهالة شريحة الموائع الدقيقة والشريحة الزجاجية المطلية ب PDMS لبضع ثوان.

أخيرا ، ضع شريحة مائع دقيق على كل شريحة زجاجية بحيث تكون القنوات متجهة لأسفل ، واخبز الرقائق طوال الليل عند 100 درجة مئوية. أولا ، باستخدام الأواني الزجاجية المغسولة بالكلوروفورم ، قم بإعداد حوالي 250 ميكروغراما من الدهون الذائبة بالكلوروفورم. جفف خليط الدهون بعناية بالغاز الخامل.

ثم ضعه في غرفة مفرغة لمدة ساعة. ثم قم بإذابة الدهون في الزيت المعدني و 2.5٪ خافض للتوتر السطحي إلى 0.5 ملليغرام لكل مليلتر ، أي حوالي 500 ميكرولتر. لإذابة الدهون تماما ، قم بصوتنة المزيج لمدة 30 دقيقة عند 40 كيلو هرتز.

بعد ذلك ، قم بتدوير معطف PDMS على غطاء زجاجي بسماكة تتناسب مع هدف المجهر. ثم قم بتدوير طبقة PDMS على شرائح زجاجية. الآن ، قم بمعالجة نظارات الغطاء والشرائح الزجاجية المطلية ب PDMS لمدة ساعة عند 100 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بعمل خلايا التدفق عن طريق التباعد بين شرائح رقيقة من فيلم مانع التسرب المختبري عن كثب على الشرائح الزجاجية المطلية ب PDMS. ضع ثلاثة شرائط ملليمترات على بعد ملليمترين تقريبا. بعد ذلك ، قم بتغطية خلايا التدفق بقلة غطاء مطلية ب PDMS ، وأغلق المجموعة عن طريق إذابة الفيلم عند 100 درجة مئوية لمدة دقيقة سريعة.

بمجرد تسخينه ، اضغط برفق على الغطاء وقم بإغلاقه ب Valap. بعد ذلك ، قم بإعداد كوب PDMS للتصوير طويل المدى. قم بعمل ثقب قطره أربعة ملليمترات في شريحة بسمك ثلاثة ملليمترات من PDMS.

بعد ذلك ، عالج الهالة شريحة PDMS وزجاج غطاء مطلي ب PDMS. بمجرد معالجتها ، ضعها فوق بعضها البعض ، واخبزها طوال الليل على حرارة 100 درجة مئوية. راقب تكوين القطرات على مجهر المجال الساطع المقلوب.

قم بتوصيل مرحلة زيت الدهون بوحدة التحكم في الضغط ، وقم بزيادة الضغط حتى تخرج قطرة زيت من أنبوب الذروة. قم بتوصيل أنبوب الذروة بمدخل اثنين من شريحة الموائع الدقيقة. بعد ذلك ، املأ رقائق الموائع الدقيقة بالكامل بمرحلة الزيت الدهني من المدخل الثاني.

بعد ذلك ، أدخل مرحلة المياه القائمة على MRB-80 من المدخل الأول. تحكم في حجم القطرات عن طريق تغيير طور الزيت الدهني وضغوط الطور المائي لإنشاء قطرات يبلغ قطرها حوالي 15 ميكرون. حوالي 800 مللي بار لمرحلة الزيت الدهني ، و 200 مللي بار لمرحلة الماء ، هي نقطة انطلاق جيدة.

بعد الحصول على حجم القطرة المطلوب ، املأ خلية التدفق بالكامل بالقطرات. تتشكل هذه القطرات باستخدام كميات صغيرة من الطور المائي. هذا يعني أن إعداد الموائع الدقيقة يحتاج إلى العمل بسرعة حتى لا يفقد مرحلة الماء بأكملها قبل تكوين قطرات بالحجم الصحيح.

بمجرد ملئها ، أغلق نهايات خلية التدفق بعناية باستخدام Valap. إذا لم تتوقف القطرات عن الحركة ، فلن يكتمل الختم ، أو ربما تم إدخال فقاعات الهواء. للتصوير طويل الأمد ، انقل القطرات إلى كوب PDMS ، وقم بتغطيتها بطبقة من خليط الدهون الزيتية.

قم بإذابة الجسيمات المركزية في درجة حرارة الغرفة ، وضعها على 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لضمان نواة الأنابيب الدقيقة المناسبة. أثناء الانتظار ، قم بإعداد مزيج الفحص على الثلج. يجب أن يحتوي هذا على التوبولين ، و GTP ، ونظام زبال الأكسجين ، ومولدات القوة الجزيئية مثل الروابط المتقاطعة للأنابيب الدقيقة ، و ATP ، ونظام تجديد ATP.

بمجرد الخلط ، قم بتدوير العينة في دوار Airfuge المبرد عند 30 رطل لكل بوصة مربعة لمدة ثلاث دقائق. ثم أضف الجسيمات المركزية المسخنة مسبقا إلى المزيج. قم بتحسين كمية الجسيمات المركزية المضافة للحصول على واحد أو اثنين من الجسيمات المركزية لكل قطرة.

بعد ذلك ، استخدم هذا الخليط لإنتاج قطرات مستحلب كما هو موضح سابقا. من أجل تجنيد الداينين في الدهون البيوتينيل في قشرة القطيرات ، قم بتضمين GFP-dynein TMR ، والستربتافيدين ، في مرحلة الماء. على مجهر ثنائي البؤر على قرص دوار ، تخيل نمو الأنابيب الدقيقة بعد 30 دقيقة عند 26 درجة مئوية.

أثناء التصوير ، يمكن تعزيز نمو الأنابيب الدقيقة عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 28 أو حتى 30 درجة مئوية. بالنسبة لإسقاطات Z ، التقط مكدسات بفواصل ميكرون واحدة ، والتي يجب أن تتطلب حوالي 20 صورة لكل قطرة. انتقل إلى لوحة الكاميرا الرئيسية ، وانقر فوق تحرير Z ، واضبط Z Step على 1.0.

انقر فوق التالي لتخزين الإعدادات. بعد ذلك ، قم بتعيين الحد الأقصى لكسب EM الخطي بالنقر فوق علامة التبويب الكاميرا في لوحة Acquisition ، وتحريك شريط EM Gain إلى 300. بعد ذلك، اضبط وقت التعرض على 200 مللي ثانية في علامة التبويب.

انقر فوق تسجيل لتخزين الإعدادات. بالنسبة لتجارب التصوير المباشر ، قم بعمل إسقاطات Z كل دقيقتين لمدة ساعتين عن طريق تقليل أوقات التعرض إلى حوالي 100 مللي ثانية ، وزيادة فترات Z إلى ميكرونين. بالنسبة لتجارب التصوير المباشر، استخدم كوب PDMS بدلا من خلية التدفق العادي لتحقيق أقصى قدر من شلل العينة.

باستخدام البروتوكولات الموصوفة ، تمت دراسة تكوين النجمة في قطرات مستحلب الزيت والماء التي تحتوي على الجسيمات المركزية. في البداية ، تنتشر الجسيمات المركزية بحرية داخل المجلدات المحصورة. بعد حوالي 20 إلى 30 دقيقة ، تصبح الأنابيب الدقيقة الأولى مرئية ، ويصبح انتشار الجسيم المركزي مقيدا مع نمو الأنابيب الدقيقة ضد القشرة في جميع الاتجاهات.

عندما تنمو الأنابيب الدقيقة لفترة أطول من نصف قطر القطرة ، يتم دفع الجسيمات المركزية إلى حدود متعارضة ، مع نمو الأنابيب الدقيقة على طول قشرة القطيرات. بدون الستربتافيدين ، ينتشر الدامين داخل القطرة. ومع ذلك ، مع الستربتافيدين ، في غضون حوالي 10 دقائق من تكوين القطيرات ، يرتبط الداينين بالدهون البيوتينية.

عند عرض التوبولين الفلوري في وجود داينين قشري ، من الواضح أن الجسيمات المركزية في وضع مركزي. بينما في حالة عدم وجود dynein ، يتم دفع الجسيمات المركزية إلى جوانب متقابلة من القطرة. ربما يرجع ذلك إلى كوارث الأنابيب الدقيقة التي تعزز الداينين وقوى السحب القشرية ، مما يؤدي إلى توسيط زهور النجمة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنيات الموائع الدقيقة لإنشاء هياكل تشبه المغزل في قطرات مستحلب كروية. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء تكوين القطرات والتصوير في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات عند إجراؤها بشكل صحيح. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تغليف عوامل تجميع المغزل الأخرى من أجل دراسة تأثيرها على مورفولوجيا المغزل وتحديد المواقع.

يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات أثناء استخدام الكلوروفورم أو PDMS.