إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات منقى بالكامل
أغسطس 10, 2021
هنا، نقدم بروتوكول مفصل لإعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات نقية بالكامل في البروتيوليبوسومات المحددة.
استخدام AAA-ATPases لإزالة البروتينات من طبقة ثنائية الدهون هو موضوع شائع في مراقبة جودة البروتين. ويتطلب الفهم الآلي لهذه العملية الأساسية نظاما أعيد تشكيله. وكانت إعادة التشكيل السابقة مع AAA-ATPases معقدة وغير متجانسة.
نظامنا بسيط ومحدد بالكامل. وهذا يسمح لنا للتلاعب في AAA-ATPase Msp1، الركيزة، والبيئة الدهنية. للبدء، إضافة المخزن المؤقت لإعادة التشكيل المعدة مسبقا، وتنقية Msp1 والبروتينات TA والدهون في أنبوب PCR، ثم احتضان الخليط على الجليد لمدة 10 دقائق.
خلال الحضانة، وقطع غيض من طرف ماصة P200 إلى حوالي 1/8 من شبر واحد في القطر. المقبل، دوامة الأنبوب الذي يحتوي على BioBeads جيدا للحصول على خليط موحد. ثم، بسرعة إزالة الغطاء واستخدام تلميح ماصة P200 قطع لنقل حجم مناسب من الخرز إلى أنبوب PCR فارغة.
بمجرد اكتمال الحضانة لمدة 10 دقائق لإعادة التشكيل ، باستخدام طرف ماصة غير مقطوع ، قم بإزالة جميع السوائل من BioBeads. ثم، نقل 100 ميكرولتر من إعادة تشكيل في أنبوب مع BioBeads والسماح لها بالتناوب على عجلة لمدة 16 ساعة. في اليوم التالي، تدور الأنبوب في PicoFuge بيليه الخرز، ثم نقل المواد المعاد تشكيلها إلى أنبوب PCR نظيفة والحفاظ على أنبوب على الجليد.
لإزالة البروتينات التي فشلت في إعادة تشكيل في الليبوسومات، equilibrate أعمدة تدور الجلوتاثيون مع العازلة استخراج، والذي ينطوي عادة على ثلاث جولات من الغسيل مع 400 ميكرولتر من العازلة، تليها الطرد المركزي لإزالة العازلة. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرومولات من كل مرافق إلى المواد المعاد تشكيلها ، تليها 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج ، ليصل حجمها إلى 200 ميكرولتر. أضف هذا الخليط إلى أعمدة الدوران الغلوتاثيونية المتساوية، ثم قم بتوصيل أعمدة الدوران وقم بتدويرها لمدة 30 دقيقة، مما يسمح للمرافقين بالارتباط بالراتنج.
بعد الدوران، قم بتدوير الأعمدة لفترة وجيزة. جمع التدفق من خلال، وهو المواد تطهيرها مسبقا استنفدت من البروتينات المجمعة. وضعه على الجليد والمضي قدما مباشرة إلى المقايسة استخراج.
إعداد أنابيب لتحليل SDS-PAGE. أضف 45 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج إلى أنبوب الإدخال ، و 40 ميكرولتر من الماء إلى الأنبوب المتدفق ، و 16.6 ميكرولتر من مخزن التحميل 4X SDS-PAGE المؤقت لكل أنبوب. بالنسبة لمقاايسة الاستخراج، قم بإعداد رد فعل الاستخراج وإحضار الحجم النهائي إلى 200 ميكرولتر مع المخزن المؤقت للاستخراج.
ثم، قبل الحرب المقايسة استخراج في كتلة الحرارة 30 درجة مئوية لمدة دقيقتين. لبدء المقايسة، أضف ATP إلى تركيز نهائي من ميليمولين. تدور الأنبوب لمدة خمس ثوان في PicoFuge، واحتضانه في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
أثناء الحضانة ، خذ عينة من خمسة ميكرولتر من التفاعل وأضفها إلى أنبوب الإدخال. أيضا، equilibrate عمود واحد تدور الجلوتاثيون لكل عينة في المقايسة استخراج كما هو موضح سابقا. وبمجرد اكتمال الحضانة لمدة 30 دقيقة، أضف 200 ميكرولتر من عازل الاستخراج إلى الأنبوب، ليصل إجمالي الحجم إلى 400 ميكرولتر.
ثم، إضافة هذا التفاعل إلى راتنج الجلوتاثيون متساوية الأضلاع والسماح لها بالتناوب لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد الدوران، قم بتدوير الأعمدة لجمع التدفق من خلال، ثم خذ عينة 10 ميكرولتر للأنبوب التدفقي. غسل الراتنج مرتين مع 400 ميكرولتر من العازلة استخراج، والتخلص من تدفق من خلال بعد كل غسل.
بعد الغسيل الثالث، حافظ على التدفق من خلال وأخذ عينة 50 ميكرولتر للأنبوب غسل. بعد ذلك، قم بإعداد خمسة ملليلترات من العازلة elution بإضافة الجلوتاثيون المنخفض إلى تركيز نهائي من خمسة ملليمولات في المخزن المؤقت للاستخراج. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة elution إلى العمود تدور واحتضان لمدة خمس دقائق.
ثم، طرد العمود وجمع التدفق من خلال. كرر خطوة الوضوء مرة أخرى. بعد elution الثاني، واتخاذ aliquot 50 ميكرولتر من عينة elution وإضافته إلى أنبوب elute.
بعد تشغيل لطخة غربية، يمكن تحديد كفاءة الاستخراج من خلال مقارنة كمية الركيزة في الكسر elute مع كسر الإدخال. تظهر الإشارة في التدفق من خلال بعض التباين، ولكن عموما مماثلة لكسر الإدخال، وليس هناك إشارة في كسر الغسيل. عادة، هناك ما يقرب من 10٪ كفاءة استخراج للسيطرة إيجابية وكفاءة استخراج 1-2٪ للسيطرة السلبية.
عندما لا يتم تحسين ظروف إعادة التشكيل، تكون مستويات الاستخراج قابلة للمقارنة بين العينات الإيجابية والسلبية. سمحت هذه التقنية لمختبرنا باختبار الخصائص الفيزيائية الحيوية للركيزة التي تؤثر على التعرف عليها من قبل Msp1.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا المقال بروتوكولاً تفصيلياً لإعادة تشكيل نشاط استخلاص Msp1 باستخدام مكونات منقاة تماماً في بروتيوليبوسومات محددة. تهدف الدراسة إلى تبسيط عملية إعادة تشكيل AAA-ATPases، والتي تُعد حاسمة لمراقبة جودة البروتين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- تلعب إنزيمات AAA-ATPases دوراً حيوياً في إزالة البروتينات من الطبقات الدهنية المزدوجة.
- يتطلب الفهم الآلي لهذه العملية وجود نظام مُعاد التكوين.
- كانت الطرق السابقة معقدة وغير متجانسة.
- تقدم هذه الدراسة نظام إعادة تكوين بسيطاً ومحدداً بالكامل.
الغرض من الدراسة
- التحكم في AAA-ATPase Msp1 والمادة الخاضعة لتأثيره.
- إنشاء بيئة دهنية محددة لغرض الدراسة.
- تعزيز فهم آليات استخلاص البروتين.
الطرق المستخدمة
- تحضير محلول إعادة التكوين المنظم.
- استخدام بروتينات Msp1 و TA المنقاة.
- دمج الليبوزومات في أنبوب PCR.
- حضن الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق.
النتائج الرئيسية
- تم وضع بروتوكول بسيط وفعال لإعادة تشكيل Msp1.
- يتيح النظام المحدد تحكماً أفضل في المكونات.
- تم تحقيق فهم معزز لعملية الاستخلاص.
- تشير النتائج إلى تحسن الكفاءة في مراقبة جودة البروتين.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة طريقة مباشرة لدراسة إنزيمات AAA-ATPases.
- تساهم الدراسة في فهم عملية استخلاص البروتينات من الأغشية.
- يمكن تطبيق هذا البروتوكول في المزيد من الأبحاث المتعلقة بضبط جودة البروتين.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول الحد من المخاطر الميكانيكية لعملية استخلاص البروتين التي تتوسطها إنزيمات AAA-ATPase، وهي مسار محفوظ لمراقبة الجودة يرتبط بالتوازن البروتيني للميتوكوندريا. ومن خلال توفير نظام مُعاد تكوينه ومحدد بالكامل بمكونات منقاة، فإنه يدعم التحقق من الأهداف وتطوير المقايسات للأمراض المرتبطة بخلل وظائف الميتوكوندريا، بما في ذلك التنكس العصبي والسرطان. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال عزل المتغيرات التي تؤثر على التعرف على الركيزة وكفاءة الاستخلاص.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء دور Msp1 في إزالة البروتينات ذات المرساة الذيلية الموجودة في أماكن غير صحيحة، مما يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف في مسارات التوازن البروتيني للميتوكوندريا.
- القيمة التشغيلية: يستخدم Msp1 منقى، وبروتينات TA، وليبوزومات للتخلص من التعقيد الخلوي، مما يسمح بالتحكم الدقيق في ATPase والركيزة والبيئة الدهنية.
- القيمة التنبؤية: يسهل تحليل العلاقة بين البنية والوظيفة في عملية التعرف على الركيزة بواسطة Msp1، مما يساعد في تحديد المركبات الرائدة للمعدِّلات الخاصة بنشاط استخلاص البروتين.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يؤسس هذا الاختبار لعملية استخلاص كمية، حيث يتم قياس الكفاءة من خلال مقارنة مستويات المادة الركيزة في السائل المستخلص مقابل المدخلات عبر تقنية Western blot.
- القيمة التشغيلية: يحدد الظروف القياسية: حضن على الثلج لمدة 10 دقائق لإعادة التشكيل، وتدوير لمدة 16 ساعة باستخدام BioBeads، واستخلاص مدفوع بـ ATP لمدة 30 دقيقة عند 30°C يليه شطف باستخدام الجلوتاثيون.
- جاهزية الاختبار: تشمل المخرجات كفاءة الاستخلاص (عادةً ~10% للضابط الموجب، و1-2% للضابط السالب)، مما يتيح اكتشاف المركبات الفعالة وفحص استجابة الجرعة في تنسيق مُعاد تشكيله.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الأهمية الانتقالية: يربط آليات التوازن البروتيني في الميتوكوندريا بنماذج الأمراض التي يرتبط فيها خلل وظيفة Msp1 بالسرطان والشيخوخة والتنكس العصبي.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يعزل المتغيرات التي تؤثر على عملية الاستخلاص—مثل تكوين الدهون والفيزياء الحيوية للركيزة—لتوضيح الارتباط بالهدف وتقليل الغموض في التحقق من صحة الأهداف في المرحلة قبل السريرية.
- الاستمرارية: يدعم الانتقال من التحقق البيوكيميائي من الهدف إلى الفحص المظهري في الأنظمة ذات الصلة بالمرض من خلال تحديد وحدة استخلاص دنيا وقابلة للتحكم.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة مراحل الاكتشاف المبكر، حيث تتيح التحقق من صحة الهدف من خلال التشريح الميكانيكي لعملية استخلاص البروتين، وهو ما يوجه تطوير المقايسات لسلسلة عمليات الفحص ويدعم اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف بناءً على ارتباط الهدف وتعديل المسار.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات حول كيفية تأثير البيئة الدهنية وخصائص الركيزة على نشاط إنزيم Msp1 ATPase وكفاءة الاستخلاص.
- المسح: يوفر منصة كمية مُعاد تشكيلها لتقييم تأثيرات المركبات على الاستخلاص المدفوع بـ ATPase، مع ضوابط إيجابية وسلبية محددة.
- التحليلات: يولد قراءات قابلة للقياس—كفاءة الاستخلاص عبر مقارنة Western blot بين كسور المادة المستخلصة وكسور المدخلات—مما يسمح بالمقارنة الإحصائية عبر الظروف المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يرتبط بالأهمية قبل السريرية من خلال نمذجة مسار مراقبة جودة محفوظ يرتبط خلله بالأمراض البشرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يسمح النظام المُعاد تشكيله باستخدام الليبوزومات بإعادة الاستخدام في المشاريع التي تدرس AAA-ATPases، أو خصوصية الركيزة، أو التعديل المعتمد على الدهون لعملية الاستخلاص.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي في مسارات استخلاص البروتين من خلال نظام محدد ومبسط.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار والتوحيد القياسي عبر استخدام مكونات منقاة وبروتوكول تدريجي (إعادة التشكيل، المعالجة بـ BioBead، التطهير المسبق للمرافقات البروتينية، الاستخلاص المعتمد على ATP، والشطف بالجلوتاثيون).
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ قرارات المتابعة أو التوقف من خلال تمكين التقييم المبكر لإمكانيات تعديل الهدف قبل إجراء المقايسات الخلوية أو المظهرية.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد أولويات الأهداف في مراقبة جودة الميتوكوندريا وفقاً للمخاطر المعدلة، وذلك عبر توضيح المسؤولية الميكانيكية ومدى قابلية استهداف الهدف.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تنقية البروتين، وإعادة تشكيل الليبوزومات، وتصميم مقايسة ATPase.
- يعتمد على توفر جهاز الطرد المركزي الفائق (ultracentrifugation) أو جهاز PicoFuge للترسيب، وأعمدة الغلوتاثيون الدورانية، وكتل تسخين يتم التحكم في درجة حرارتها.
- يستلزم توحيد تكوين الدهون، ونسب البروتين إلى الدهون الفوسفاتية، وتركيز ATP عبر المختبرات لضمان كفاءة استخلاص قابلة للتكرار.
- قد يتطلب التكييف مع بروتينات TA أخرى أو AAA-ATPases تحسين محلول إعادة التشكيل، ووقت الحضانة، وخطوات إزالة الدهون القائمة على الخرزات.
- تشمل القيود العملية التباين في إشارة التدفق النافذ والاعتماد على حساسية لطخة ويسترن للركائز ذات الوفرة المنخفضة، كما ورد في المصدر.
