إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

الهدف العام من عملية تحضير العينة هذه هو إنتاج تلطيخ قوي ومتسق للأجسام المضادة لعينات متنوعة لتمكين استجواب مجموعات الخلايا غير المتجانسة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة حول هوية الخلية وإشارات الخلية واستجابة الخلية في مجموعة خلايا معقدة غير متجانسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس مستويات البروتين ذات المعلمات العالية على مستوى الخلية الواحدة.

ستظهر هذا الإجراء أوندريتا دنكان ، طالبة دراسات عليا من مختبرنا. لكل عينة معلق خلية واحدة ، أعد تعليقها عند أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر في وسط خال من المصل ، وأضف 500 ميكرولتر من 50 MicroMolar Cisplatin المحضر حديثا لكل 2/10 في الخلايا الست ، واحتضان العينات على شاكر مداري مع خلط مستمر في درجة حرارة الغرفة. بعد دقيقة واحدة ، قم بإخماد Cisplatin بحجم متساو من عازلة الغسيل وقم بالطرد المركزي للخلايا.

تخلص من المادة الطافية واغسل العينات مرتين أخريين عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول الغسيل ، والطرد المركزي للخلايا ، وسكب مخزن الغسيل. اتبع ذلك بغسلتين في 500 ميكرولتر من PBS بالمثل ، وبالمثل ، ويقوم بالطرد المركزي للعينات والتخلص من المادة الطافية. بعد غسل PBS الثاني ، أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من PBS الطازج وقم بإصلاح الخلايا ب 500 ميكرولتر من 4٪ PFA.

ماصة الخلايا المراد خلطها. ثم ضع العينات على شاكر المداري مع الخلط المستمر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، واسكب المادة الطافية ، واتبع ذلك بغسل في PBS الطازج.

لاختراق الخلايا ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وتخلص من المواد الطافية. أعد تعليق العينات في PBS المتبقي عن طريق دوامة لطيفة ، وأضف على الفور ملليلتر واحد من الميثانول بنسبة 100٪ لكل 2/10 10 إلى الخلايا السادسة مع ماصة لطيفة. احتضان العينات بأربع درجات لمدة ساعة واحدة على الأقل ، وفي نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا.

بعد ذلك ، اسكب الميثانول. ثم اغسل الكريات في مليلتر واحد من مخزن الغسيل لكل مليلتر من الميثانول ، متبوعا بغسلتين أخريين في 500 ميكرولتر من محلول الغسيل الطازج. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مضبوطة على 50 ميكرولتر ، انقل مخزن الغسيل المتبقي من كل حبيبات إلى أنبوب من كوكتيل الجسم المضاد المناسب.

الماصة بعمل نسخة احتياطية من المحلول المركب دون سحب الهواء إلى الطرف عن طريق إبقاء المكبس مكتطا جزئيا. ثم انقل طرف الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول الغسيل دون تحرير المكبس. حرر المكبس ، وارسم المخزن المؤقت للغسيل لحجم كوكتيل إجمالي للأجسام المضادة يبلغ 50 ميكرولترا وقم بتسمية العينة المقابلة المناسبة بكوكتيل الأجسام المضادة المستنشقة عن طريق سحب العينة اللطيف.

بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز المستمر ، اغسل العينات أربع مرات ، واسكب مخزن الغسيل في كل مرة. لتسمية الخلايا بالإيريديوم ، أعد تعليق الكريات النهائية في 500 ميكرولتر من PBS ، متبوعا بإضافة 500 ميكرولتر من أربعة بالمائة من PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من 62.5 نانومولار من الإيريديوم و PFA المحضر حديثا إلى العينات لمدة 15 دقيقة أخرى من اهتزاز درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا ، واسكب المادة الطافية ، وتبعها غسلتان في 500 ميكرولتر من 0.1 في المائة BSA والماء منزوع الأيونات المصفى. قم بتحليل العينات عن طريق إضافة حبات التطبيع في آبار ألواح العينة ، وسحب الخلايا في هذه الآبار ثم إجراء قياس الكتلة الخلوية في غضون 24 ساعة. بعد تطبيع شدة الإشارة ، يمكن إزالة حبات المعايرة من البيانات عن طريق البوابات على مجموعة سلبية حبة الإيريديوم 191.

يمكن بعد ذلك بوابات أحداث الخلية المفردة لإزالة الحطام ومضاعفات الخلايا باستخدام مخطط ثنائي المحور للتعبير السلبي للإيريديوم 193 مقابل طول الحدث. يمكن استخدام ملصقات سيسبلاتين لقياس مقدار عمق الخلية. على سبيل المثال ، يتم عرض عينات تحتوي على كميات منخفضة وأعلى من الخلايا الميتة.

يمكن إزالة الخلايا الميتة عن طريق إبعاد مجموعة البلاتين 198 الإيجابية ، وينتج عن الترميز الشريطي فصلا واضحا للعينات ضمن معلمات الترميز الشريطي ، مما يسمح بتعيين الخلايا إلى هويات العينة الأصلية. يمكن استخدام ملصقات متعاطي المخدرات بالحقن للكشف عن خلايا الوجه الأمريكية التي لوحظت هنا. بعد التطبيع الأولي وإلغاء الترميز الشريطي والبوابات ، يمكن تحليل البيانات عالية الأبعاد باستخدام خوارزمية SPADE لإنشاء تمثيل أقل أبعاد للبيانات أكثر قابلية للتفسير المرئي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون أربع إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل فقدان العينة أثناء القيام بخطوة الغسيل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات لتحليل قياس الكتلة الخلوية.

لا تنس أن العمل مع أزيد الصوديوم يمكن أن يكون خطيرا ، لذلك يجب عليك استخدام الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند تنفيذ هذا الإجراء.