الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الطريقة الصحيحة للضبط اليومي وتحليل العينات باستخدام جهاز CyTOF. أولاً، يتم تجميع الجهاز وتشغيله. بعد ذلك، يتم تحسين إعدادات الجهاز أثناء الضبط للوصول إلى أقصى إشارة.

بعد ذلك، تصبح الآلة جاهزة لتحليل العينات. وفي الخطوة النهائية، يتم تنظيف الآلة وإيقاف تشغيلها. وفي النهاية، يمكن الحصول على بيانات خلوية مثالية وفقًا لمتطلبات زمنية محددة.

يعتبر العرض المرئي لهذه التقنية أمراً بالغ الأهمية؛ إذ يصعب تعلم إجراءات الإعداد والضبط والتنظيف اليومية من خلال الدليل فقط، نظراً لوجود خطوات برمجية متعددة ومتزامنة متضمنة في العملية.

يجب عليك اكتساب الخبرة لتكوين تصور عن مستويات الخلفية وشدة الإشارات المناسبة. قبل 15 دقيقة على الأقل من بدء التجربة، افتح برنامج CyTOF واختر إعداد الجهاز (instrument setup). ثم في علامة تبويب حامل البطاقات (card cage tab)، انقر فوق زر السخان (heater on) للسماح لغطاء غرفة الرش بالوصول إلى 200 °C.

استبدل المحقنة في مضخة المحاقن بمحقنة جديدة مملوءة بماء milli cube. بعد ذلك، قم بتنظيف المرذاذ عن طريق الغسل العكسي باستخدام Citron بتركيز 5% مرتين لكل منفذ. ولإزالة أي بقايا من الـ Citron، كرر عملية الغسل العكسي باستخدام ماء Milli Q.

بعد ذلك، افتح صمام خزان غاز الأرجون، مما يؤدي إلى إضاءة مصباح الأرجون الموجود في مقدمة الجهاز. ثم قم بتوصيل المرذاذ بمدخل غاز التكميل، وقم بتوصيل المرذاذ بأنبوب إدخال السائل. أدخل طرف المرذاذ في الفتحة البيضاء الموجودة في غطاء التسخين ضمن علامة تبويب وحدة تحكم RFG في نافذة إعداد الجهاز.

انقر فوق بدء البلازما (start plasma)، ثم انقر فوق موافق (okay). بعد انتهاء عملية التشغيل، انقر فوق موافق (okay) مرة أخرى في النافذة المنبثقة. الآن قم بتشغيل مضخة السرنجة.

عند إعادة ملء المحقنة، اضغط على زر الإيقاف بدلاً من زر التوقف المؤقت لإعادة ضبط عداد الحجم. قبل معايرة جهاز قياس التدفق الخلوي الكتلي (mass cytometer)، تأكد من تركه ليدفأ لمدة 20 دقيقة. بمجرد استقرار الجهاز، انقر فوق زر إعدادات الاستحواذ لفتح نافذة إعدادات استحواذ البيانات. وفي علامة تبويب المواد المراد تحليلها (analytes).

انقر فوق الجدول الدوري لفتح لوحة اختيار النظائر. ثم حدد النظائر الموجودة في محلول ضبط DVS sciences المدرجة في الدليل وانقر فوق حفظ. بعد ذلك، انقر فوق زر النظائر لكل قراءة لفتح نافذة الكتل لكل قراءة.

حدد عدد النبضات وأعد تحجيم المحور y عن طريق إدخال رقم جديد ثم الضغط على مفتاح enter. الآن، املأ سرنجة حقن معيارية خضراء سعة 1 mL بمحلول الضبط. أدر مفتاح اختيار منفذ العينة إلى وضع التحميل (load).

احقن 450 µL من محلول الضبط، ثم أدر المفتاح للحقن. انتظر حتى تبدأ نظائر محلول الضبط في الظهور على شكل خطوط في هذه الشاشة. إن الإشارات في منطقة زمن الطيران بين 9,400 و 9,800 ناتجة عن نظائر الزينون الموجودة في غاز الأرجون.

الآن عُد إلى الكتلة لكل نافذة قراءة وانقر على زر التشغيل الأخضر. يمثل كل خط ملون نظائر مختارة من علامة تبويب المحللات. عندما تستقر مستويات النظائر، قم بضبط التيار الحالي من القائمة المنسدلة في علامة تبويب المعلمات في نافذة إعدادات الحصول على البيانات.

في نافذة البدء، أدخل صفرًا للقيمة النهائية (finish)، وأدخل 10 للنهاية. وبالنسبة لقيمة الخطوة (step value)، أدخل 0.5، ولوقت الاستقرار (settling time)، أدخل 200. ثم انقر فوق حفظ.

بعد ذلك، انقر مرة أخرى على نافذة الكتل لكل قراءة (masses per reading) وانقر على زر التشغيل. بعد ملاحظة مكان ذروة إشارات النظائر، انتقل إلى علامة تبويب إعداد قناة DAC في نافذة إعداد الجهاز. قم بالتمرير لأسفل وصولاً إلى "التيار" (current) وأدخل قيمة ذروة النظير.

انقر فوق تعيين قيمة التيار الفعلية، ثم احفظ الإعدادات. بعد ذلك، قم بتغيير القائمة المنسدلة إلى غاز التعويض (make up gas). أدخل 0.55 في نافذة البداية، و0.95 في نافذة النهاية، و0.05 في نافذة قيمة الخطوة، و200 في نافذة وقت الاستقرار.

انقر على حفظ. بعد العودة إلى نافذة الكتل لكل قراءة والنقر على تشغيل مرة أخرى، سيعرض المحور x الآن معدل تدفق غاز التكوين. دون ملاحظة القيم التي تصل عندها إشارات النظائر إلى الذروة، ولاحظ الزيادة السريعة في إشارة GD 1 55 بالقرب من النهاية.

بعد ذلك، عد إلى علامة تبويب إعداد قناة DAC. قم بالتمرير لأسفل إلىmakeup, gas، وأدخل قيمة ذروة النظير الجديدة. انقر فوق تعيين القيمة الحالية الفعلية.

ثم انقر على حفظ مجدداً لتسجيل نسبة النظير المطلوب مقابل الأكسيد. أولاً، قم بإجراء حقنة ثانية من محلول الضبط بحجم 450 microliter. ثم في علامة تبويب المعلمات، اختر الوقت من القائمة المنسدلة وأدخل صفر في نافذة البداية، و10 في نافذة النهاية، وواحد في نافذة قيمة الخطوة، و200 في نافذة الاستقرار.

بعد النقر على زر التشغيل (play) في نافذة الكتل لكل قراءة (masses per reading)، استخدم المؤشر لقراءة القيمة الأعلى لـ TM 1 69 أو TB 1 59، وكذلك قيمة GD 1 55. الآن، احقن 3 mL من ماء Milli Q عبر حلقة العينة، يليه 500 µL من محلول غسيل DVS. في علامة تبويب معايرة الكتلة (mass calibration)، انقر على تشغيل (run) لمراقبة تقدم عملية غسيل التنظيف حتى تبدأ شدة الخطوط في الانخفاض.

بعد ذلك، أضف ثلاثة ملليلتر من ماء milli cube وراقب العملية حتى تنخفض الخطوط إلى مستويات الخلفية. ابدأ بإدخال نظائر العينة التي تم توضيحها للتو في مكان نظائر محلول الضبط، ثم انقر على حفظ. بعد ذلك، افتح نافذة الاستحواذ وقم بتغيير إعدادات الاستحواذ حسب الحاجة وفقاً لحجم العينة.

على سبيل المثال، ستملأ عينة بحجم 450 µL حلقة العينة وتستغرق 600 ثانية للتشغيل للسماح بالتأخير في الحصول على بيانات الخلايا. اضبط تأخير الحصول على البيانات على 30 ثانية على الأقل وتأخير استقرار الكاشف على 20 ثانية على الأقل قبل التشغيل. اغسل عينات الخلايا مرتين على الأقل باستخدام ماء milli cube، ثم أعد تعليق العينة بتركيز أقصى يصل إلى 10⁶ خلية/مل، وقم بترشيح محلول الخلايا الناتج عبر مصفاة خلايا بقطر 35 µm.

لإزالة أي تكتلات. الآن، أدخل اسم ملف جديد للعينة الحالية. لاحظ أنه يجب حفظ جميع الملفات في القرص E.

بعد ذلك، قم بتحويل صمام حلقة العينة إلى وضع التحميل (load)، ثم احقن العينة، وأعد صمام حلقة العينة مرة أخرى إلى وضع الحقن (inject)، ثم انقر على تشغيل (run). في نافذة الاستحواذ، ستظهر الخلايا في نافذة اللقطة كمجموعات أفقية من العلامات في كل قناة نظيرية رأسية، وستُظهر أفضل دقة عند معدل يتراوح بين 300 إلى 500 خلية في الثانية كما هو موضح هنا.

عندما تكتمل عملية الحصول على بيانات العينة، ستظهر نافذة منبثقة. انقر فوق "موافق" لتأكيد اكتمال تشغيل العينة، ثم احقن 500 µL على الأقل من ماء MQ بين كل عينة وأخرى للمساعدة في تقليل أي انتقال للمواد من عينة إلى أخرى ولتنظيف الجهاز. بعد الاستخدام، احقن 450 µL من محلول الغسيل في حلقة العينة. راقب تحرر المعادن الحرة، ثم اشطف حلقة العينة باستخدام 3 mL من ماء milli Q مع مراقبة عملية الغسيل حتى يتم الوصول إلى مستويات الخط الأساسي.

لإيقاف تشغيل الجهاز، اختر علامة تبويب وحدة تحكم RFG في نافذة إعداد الجهاز وانقر على "إيقاف البلازما" (stop plasma). وعند اكتمال الإجراء، انقر على "موافق" (okay) في النافذة المنبثقة، والتي توصي بإزالة المرذاذ من علامة تبويب قفص البطاقات. أوقف تشغيل السخان، وأغلق الصمام الموجود في مصدر إمداد argonne، ثم اسحب المرذاذ للخلف بعناية لإزالته من غرفة الرش.

بعد ذلك، قم بفك أنبوب إدخال العينة وضعه جانباً. قم بفك وصلة إدخال غاز التخفيف حتى ترتخي قليلاً، ثم اسحب المرذاذ. وأخيراً، وباستخدام المحقنة والأنبوب ذاتهما كما تم توضيحه سابقاً، قم بتنظيف كلا منفذي المرذاذ باستخدام 5%Citron، ثم احفظ المرذاذ مغطىً بـ 5%Citron حتى الاستخدام التالي.

إن الغسل الكافي لمقياس التدفق الخلوي الكتلي (mass cytometer) باستخدام مياه UE ومحلول الغسل DVS سيقلل من مستويات امتصاص المعادن في الأنابيب وأجزاء الجهاز الأخرى، مما يساعد في تقليل أي خلفية كما هو موضح في هذه الرسوم البيانية. وقد أدى الضبط غير الصحيح، الممثل بالخط الأرجواني، إلى زيادة تكوين الأكسيد عند m زائد 16 بشكل ملحوظ مقارنة بالعينة المضبوطة بشكل صحيح كما يظهر في الخط الأزرق الداكن. ويؤدي ذلك إلى خفض الإشارات المطلوبة عند m بشكل طفيف، وزيادة تداخل الخلفية غير المرغوب فيه عند m زائد 16 بشكل كبير.

سيضمن الغسل الصحيح والتخفيف المناسب للعينات في مياه Milli Q تقليل الخلفية إلى أدنى حد وتحقيق أعلى دقة للخلايا مع تحقيق التوازن مع الحاجة إلى السرعة. وعلى غرار البيانات الواردة من تجربة ممثلة معروضة هنا، تم تشغيل حبيبات البوليسترين التي تحتوي على الوفرة الطبيعية من lanthanum 1 39 ODIUM one 40 و TERBIUM 1 59 و DIUM 1 69 و LUTETIUM 1 75 في وضع الحصول على الخلايا. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo، وتم استبعاد الحطام الناتج عن أي حبيبات مكسورة عن طريق تقنية البوابة (gating).

تَم تحديد العينة المضبوطة بشكل صحيح عند معدل تدفق 0.74 liters per minute كما هو موضح بالخط الأزرق الداكن. لُوحظ وجود شدة إشارة أعلى عند معدل التدفق هذا مقارنة بمعدلات التدفق الأقل، كما لُوحظ أن هذه العينة المضبوطة بشكل صحيح تعطي إشارة أعلى عند كتل المعادن M وإشارة أقل عند كتل الأكاسيد m plus 16 مقارنة بالإشارات غير المضبوطة. ويظهر هنا تكبير للإشارة عند كتلة M لكل من LANTHANUM 1 39 و THULIUM 1 69.

لاحظ أن معدل تدفق غاز التعويض يؤثر على شدة إشارة LANTHANUM 1 39 بشكل أكبر من تأثيره على شدة إشارة thulium 1 69. توضح هذه الرسوم البيانية الإشارة عند كتل الأكاسيد m plus 16 وهي 1 55 و 180 5، والتي تقابل أكاسيد LANTHANUM 1 39 plus oh 16 و thulium 1 69 plus oh 16 على التوالي. لاحظ أن معدل تدفق غاز التعويض يزيد من إشارة الكتلة 1 55 بشكل أكبر بكثير من إشارة الكتلة 180 5، نظراً لأن lanthanum 1 39 يتأكسد بسهولة أكبر من thulium 1 69.

تظهر هنا شدة إشارات m و m زائد 16 كدالة لمعدل تدفق غاز التكميل. تمثل الأيقونات الممتلئة الكتلة M، بينما تمثل الأيقونات المفتوحة الكتلة M زائد 16، وتتوافق ألوان الخطوط مع الكتلة M المقابلة. يلاحظ أن شدة إشارات LANTHANUM 1 39 و price ODIUM 1 41 تتأثر بشدة بمعدل تدفق غاز التكميل، لدرجة الوصول إلى نقطة تتواجد فيها كمية من أكسيد الكتلة m زائد 16 أكثر من الكتلة M. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل جهاز CyTOF وضبطه بشكل صحيح، ثم تحليل عيناتك، وأخيرًا تنظيف الجهاز وإغلاقه بشكل صحيح في نهاية جولات التشغيل اليومية.