عزل وتوصيف الخلايا الجذعية والضامة من الأمعاء ماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو العزل السريع للخلايا الغصنية (DCs) والبلعميات من أمعاء الفأر من أجل التوصيف المظهري والوظيفي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حصاد أنسجة الأمعاء، ثم تليها الخطوة الثانية وهي فصل الظهارة المعوية عن الصفيحة المخصوصة (Lamina propria).

بعد ذلك، يتم هضم الصفيحة المخصوصة المعوية خلال الخطوات النهائية من الإجراء. تُصبغ خلايا الصفيحة المخصوصة باستخدام الفلوريسنت والأجسام المضادة المقترنة، ثم يتم فرزها لتحديد مجموعات خلوية معينة. وفي النهاية، يمكن توصيف مجموعات الخلايا التغصنية والبلعمية المعوية بدقة أكبر وتنقيتها لإجراء الدراسات الوظيفية لتقييم إنتاج السيتوكينات وعرض المستضد وتنظيم الخلايا المناعية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن سرعة هضم الأنسجة تضمن التعبير الأمثل لمستضدات سطح الخلية، وحيوية الخلايا، و/أو سلامتها الخلوية. بعد قتل الفأر رحمةً والتأكد من الوفاة عبر اختبار منعكس قرص الإصبع، قم برش 70%ethanol على بطن وصدر الحيوان. ثم استخدم مقصاً لإجراء شق أفقي صغير في منتصف البطن وقم بإزاحة الجلد للكشف عن الصفاق.

افتح البريتون باستخدام المقص بعد القص عند المصرة البوابية لفصل المعدة عن الجزء العلوي من الأمعاء الدقيقة، وباستخدام الملاقط لإزاحة المساريقا. قص مرة أخرى عند الصمام اللفائفي الأعوري لتحرير الأمعاء الدقيقة بالكامل من الأمعاء الغليظة. استمر في فصل المساريقا عن الأمعاء الغليظة وقم بإجراء قطع عند الحافة الشرجية.

استخدم المقص لفتح القولون طولياً، واستخدم محلول C-M-F-P-B-S بدرجة حرارة الغرفة لغسل المحتويات البرازية والمخاط من تجويف الأمعاء. بعد ذلك، استخدم المقص والملاقط لإجراء تشريح عياني لاستئصال بقع باير (pyres patches) على طول السطح المضاد للمساريقا في الأمعاء الدقيقة، ثم افتح الأمعاء الدقيقة طولياً.

بعد ذلك، قم بتنظيف تجويف الأمعاء الدقيقة من المحتويات البرازية والمخاط باستخدام المزيد من محلول C-M-F-P-B-S في درجة حرارة الغرفة. وبشكل منفصل، قطع الأمعاء الدقيقة والغليظة إلى قطع يبلغ طولها حوالي 1.5 centimeter وضع القطع في أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter فردية تحتوي على 30 milliliters من محلول C-M-F-H-B-S-S المبرد مسبقاً مع FBS و 2 millimolar EDTA. ضع كل أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter بشكل أفقي في هزاز مداري، مع رج الأنابيب بسرعة 250 RPM لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius.

بعد ذلك، ضع مصفاة سلكية شبكية واحدة فوق دلو نفايات. صب محتويات كل أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter من خلال الشبكة لاستعادة قطع الأمعاء، ثم ضعها في أنابيب مخروطية فردية جديدة سعة 50 milliliter تحتوي على 30 milliliters من Prewarm C-M-F-H-B-S-S with FBS مع 2 millimolar EDTA. وأخيراً، أعد الأنابيب إلى الهزاز المداري لمدة 20 دقيقة أخرى.

بعد جولة الرج الثانية، صب محتويات كل أنبوب عبر المصفاة. مرة أخرى، جفف الوسائط الزائدة باستخدام مناديل ورقية، ثم انقل قطع الأمعاء إلى وعاء بلاستيكي صغير (whey boat). إن الجانب الأكثر صعوبة في هذه التقنية هو هضم الأنسجة؛ ولضمان النجاح، يجب مراعاة جميع المعايير المختلفة المتمثلة في مدة الهضم، وخصائص إنزيم collagenase، وسلامة الأنسجة، وحجم النسيج المراد هضمه باستخدام المقص بسرعة.

قم بتقطيع قطع الأمعاء، ثم أضف الأمعاء المفرومة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليمتر يحتوي على 20 ملليلتر من محلول الكولاجيناز. ضع الأنبوب المخروطي بشكل أفقي في الهزاز المداري واهضم قطع الأمعاء بسرعة 200 RPM لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. الآن، قم برج الأنبوب لفترة وجيزة باستخدام جهاز الفورتكس لضمان التفكك التام لأي أنسجة معوية متبقية، ثم قم بتصفية ملاط الخلايا عبر مصفاة خلايا بمسامية 100 ميكرون مباشرة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر.

أخيراً، أكمل ملء الأنبوب المخروطي بوسط C-M-F-H-B-S-S مع FBS وقم بطرد محلول الخلايا مركزياً مرتين لمدة خمس دقائق عند 425 ×g في درجة حرارة أربع درجات مئوية. ثم تخلص من الراسب العلوي وأعد تعليق كتلة الخلايا في وسط C-M-F-H-B-S-S مبرد بالثلج مع FBS وضع العينات على الثلج. بعد ذلك، يتم صبغ الخلايا للبروتينات السطحية المستهدفة.

ابدأ بإنشاء مخطط نقطي (dot plot) مع استبعاد الخلايا الموجبة لصبغة الخلايا الميتة كما هو موضح هنا. بعد ذلك، استبعد أحداث الخلايا المزدوجة (doublet events) كما هو موضح هنا وهنا. الآن، استخدم قناتي التشتت الأمامي والجانبي لتحديد الخلايا المستهدفة (gate)، مع التأكد من استبعاد الحطام الخلوي.

بعد ذلك، قم بإنشاء مخطط نقطي آخر يعتمد على اختيار الخلايا الموجبة لـ CD 45 والموجبة لـ IAB. في مخطط نقطي منفصل للخلايا المقدمة للمستضد، قم بإنشاء مناطق لتمييز مجموعات فرعية محددة من الخلايا التغصنية والخلايا البلعمية. المنطقة R1 الموضحة هنا تشمل الخلايا الموجبة لـ CD 11 C والسالبة أو ذات التعبير الضعيف لـ CD 11 B.

تحدد المنطقة R two الخلايا التي تمتلك مستوى مماثلاً من التعبير السطحي لـ CD 11 C مثل الخلايا الموجودة في المنطقة R one، ولكنها تعبر أيضاً عن CD 11 B. بينما تشير مناطق R three إلى الخلايا الإيجابية لـ CD 11 B والسلبية الباهتة لـ CD 11 C. ويمكن تحليل هذه المناطق الثلاث بشكل أكبر للكشف عن تعبير F four 80 و CD 1 0 3 للتمييز بين مجموعات الماكروفاج والخلايا التغصنية (DC) على التوالي. وكما يظهر في هذا المخطط النقطي، فإن الخلايا الإيجابية لـ CD 11 C والسلبية الباهتة لـ CD 11 B في المنطقة R one ستعبر عن مستويات عالية من alpha ein CD 1 0 3 ومستويات منخفضة من F four 80.

يوضح هذا المخطط النقطي أن الخلايا الموجبة لـ CD 11 B والموجبة لـ CD 11 C في المنطقة R two ستتكون من كل من الخلايا التغصنية (DCs) والبلعميات بناءً على تعبيرها الثنائي لـ CD 1 0 3 و F four 80. وأخيراً، وبناءً على ملفها المظهري الموجب لـ F four 80 والسالب لـ CD 1 0 3، فإن الخلايا الموجبة لـ CD 11 B والسالبة لـ CD 11 C (أو التي تفتقر إليه) المحددة في المنطقة R three ستتكون من البلعميات. كما توضح الأشكال الستة التالية العلاقة بين مدة هضم الأنسجة وإجمالي حصيلة الخلايا وتعبير CD 11 B و CD 11 C. إن أنسجة الأمعاء التي يتم هضمها لمدة ثلاث دقائق تعطي عدداً إجمالياً منخفضاً من الخلايا، مما يؤدي إلى توفر عدد قليل من الخلايا التغصنية والبلعميات للتوصيف، بينما ينتج هضم الأنسجة لمدة 11 دقيقة حصيلة قوية من الخلايا الحية، مما يعطي مجموعات من الخلايا التغصنية والبلعميات التي تعبر عن مستويات عالية من CD 11 B و CD 11 C وتكون متميزة مظهرياً.

في المقابل، يؤدي الهضم لمدة 50 دقيقة إلى الحصول على إنتاجية خلايا مماثلة لتلك الناتجة عن الهضم المُحسَّن. ومع ذلك، يصبح تمييز المجموعات الخلوية المختلفة باستخدام CD 11 B وCD 11 C أكثر صعوبة، حيث ينخفض تعبير CD 11 C ويزداد عدد الخلايا الميتة.

وبذلك، ومن خلال تحسين بارامترات هضم الأنسجة المعوية، يمكن تحقيق حصيلة خلوية قوية وبسرعة. ونتيجة لذلك، يمكن أن يكون العزل السريع للخلايا التغصنية والبلاعم من أمعاء الفأر مفيداً لتقييم الخصائص الوظيفية للخلايا المناعية ذات المستضدات السطحية السليمة.