Adenofection: منهج في دراسة دور الجزيئية الوصيفات في الخلوي Morphodynamics من التجارب استنفاد الانقاذ

الهدف العام من هذه الطريقة هو تمكين إجراء تجارب إنقاذ الاستنفاد في ظل ظروف تحافظ على السلامة الخلوية والتوازن البروتيني، وذلك لإجراء تحليلات وظيفية للعمليات البيولوجية على مستوى الخلية الواحدة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بوظائف البروتين ومتطلبات البنية في ديناميكيات الخلية مثل الانقسام الفتيل وتمايز الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استنفاد البروتين المستهدف وإعادة إدخال نسخة بديلة من هذا البروتين في الوقت ذاته بمستوى قريب من المستوى الفسيولوجي في غالبية المجموعة الخلوية.

ابدأ بطلاء الأطباق ذات القاع الزجاجي بالفيبرونكتين. وللقيام بذلك، خفف مخزون الفيبرونكتين بتركيز 1 mg/mL بنسبة 1 إلى 100 باستخدام PBS معقم.

أضف 1 mL إلى كل طبق سعة 35 mL لتغطية السطح بالكامل. يتم التحضين لمدة ساعة واحدة عند 37 °C و 5% carbon dioxide. وأثناء التحضين، يتم تسخين alpha MEM المكمل بـ 10% FBS وعينة من 0.05% trypsin EDTA مسبقاً إلى 37 °C.

بعد 45 دقيقة من الحضن، ابدأ في تحضير المحلول الخلوي. قم بشفط الوسط من طبق بقطر 10 سنتيمتر يحتوي على خلايا HeLa-RFP-H2B. ثم اشطفها برفق مرتين باستخدام 1.5 milliliters من 0.05% trypsin EDTA.

اترك 0.5 milliliters من trypsin EDTA في الطبق بعد عملية السحب الأخيرة، ثم حضن الخلايا لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق عند 37 °C و5% carbon dioxide.

انقر بلطف على الطبق وافحص طبقة الخلايا تحت المجهر للتأكد من انفصال جميع الخلايا. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من الوسط الغذائي واستخدم الماصة بلطف لعدة مرات لفصل الخلايا، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 15 milliliter.

قم بعدّ عينة بحجم 10 µL من معلق الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). بعد ذلك، قم بشفط محلول الفبرونيكتين من الأطباق ذات القاعدة الزجاجية. احرص على عدم ترك الفبرونيكتين ليجف قبل زراعة الخلايا.

قم بتحضير محلول معلق خلوي لزراعة 1.5 × 10⁵ من الخلايا لكل طبق بقطر 35 مليمتر في 2 مل من الوسط الغذائي. ازرع طبقاً إضافياً بقطر 35 مليمتر زيادة على عدد الظروف التجريبية، وذلك لعد الخلايا قبل عملية ترنسدكشن الفيروس. قم بالتحضين لمدة تتراوح بين 30 إلى 45 دقيقة. بعد انتهاء وقت التحضين، افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا منفصلة جيداً، كما هو موضح هنا. أعد الأطباق إلى الحاضنة واترك الخلايا تنمو حتى اليوم التالي.

في اليوم التالي لعملية الزرع، تأكد من وصول الخلايا إلى كثافة لا تقل عن 50%. إذ تؤدي كثافة الخلايا التي تقل عن 50% إلى انخفاض كفاءة ترانسدكشن الفيروس، وزيادة التباين في تعبير البروتين لكل خلية، وزيادة سمية الخلايا. بعد ذلك، قم بحصد الخلايا من طبق الزرع الإضافي كما سبق وقم بعدّ عدد الخلايا. احسب حجم الفيروسات المطلوب لإجراء ترانسدكشن فعال للخلايا. قم بتمييز أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter لكل حالة، وأضف 400 microliters من وسط alpha MEM minus الدافئ. بعد إذابة حصص الفيروسات ببطء على الثلج، أضف الحجم المطلوب من كل فيروس إلى الأنابيب واخلط برفق باستخدام الماصة. بعد ذلك، وبعد شفط الوسط من الخلايا، أضف خليط الفيروسات برفق على شكل قطرات. قم بحضن الخلايا عند 37 degrees Celsius مع 5% carbon dioxide. كل 15 minutes ولمدة ساعة واحدة، قم برج الأطباق بعناية تحت غطاء التعقيم لتغطية الخلايا بالفيروس. إن استخدام كمية صغيرة من الوسط يسهل تلامس الفيروس مع الخلايا.

بعد فترة التحضين، انقل بلطف 1.6 milliliters من alpha MEM minus إلى كل طبق للحصول على حجم إجمالي قدره 2 milliliters. ثم ابدأ عملية المزامنة الخلوية بإضافة 2 millimolar من thymidine قبل تحضين الخلايا لمدة ساعتين إضافيتين.

وفي هذه الأثناء، قم بتحضير مزيج ترنسفكشن siRNA عن طريق إضافة 139 µL من الماء المعقم، و50 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 1 M، و11 µL من siRNA بتركيز 20 µM في أنبوب دقيق. في حال عدم الحاجة إلى siRNA، استبدل كمية siRNA بالماء المعقم لإجراء عملية ترنسفكشن فارغة. أضف محلول HBSS-2X ببطء على شكل قطرات إلى خليط كلوريد الكالسيوم وsiRNA. اخلط المزيج بلطف مرتين عن طريق الحقن الهوائي باستخدام ماصة 200 µL، حيث تؤدي الرواسب الأصغر حجماً إلى تحسين كفاءة الترنسفكشن. بعد ذلك، قم بحضن المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد فترة الحضانة، أضف 200 µL ببطء على شكل قطرات إلى كل طبق وقم بالرج للمزج. احضن الأطباق عند 37 °C و5% CO2 لمدة 16 ساعة.

في اليوم التالي، أخرج الأطباق من الحاضنة وانقلها إلى غطاء تدفق هوائي لزراعة الأنسجة. بعد شطف الخلايا مرتين باستخدام 2 mL من HEPES الدافئ، أضف 2 mL من alpha MEM minus قبل إعادتها إلى الحاضنة.

بعد مرور سبع ساعات، أضف ثيميدين بتركيز 2 millimolar إلى الأطباق قبل إعادتها إلى الحاضنة. يجب العمل على ما لا يزيد عن أربعة أطباق خلوية في المرة الواحدة لأن التباينات في درجات الحرارة تؤثر على طول الدورة الخلوية. وفي اليوم التالي، أي بعد مرور 48 ساعة من عملية ترانسفكشن siRNA والعدوى الفيروسية، اشطف الخلايا مرتين باستخدام 2 milliliters من PBS الدافئ، ثم أضف 2 milliliters من alpha MEM الخالي من الفينول الأحمر من أجل التصوير الحي للخلايا. ثم تُحضن الخلايا لمدة سبع ساعات.

أجرِ تجارب تصوير الخلايا الحية قصيرة المدى على الخلايا في طور الانقسام الميتوزي باستخدام مجهر مقلوب مجهز بغرفة تنظيم حراري مرطبة بنسبة 5% من ثاني أكسيد الكربون. وقبل البدء في عملية الالتقاط، تحقق من وصول الغرفة إلى درجة الحرارة المناسبة وهي 37 درجة مئوية.

ضع أطباق المزارع في غرفة المجهر قبل ساعة واحدة من عملية الاستحواذ لضمان تحقيق التوازن المناسب للوسط وتجنب انزياح التركيز الناتج عن تغيرات درجة الحرارة. افحص الحالة الانقسامية للخلايا. في هذه المرحلة، يجب أن تكون 10 إلى 15% من الخلايا في المراحل المبكرة من الانقسام الفتيلي.

خلال وقت التوازن، قم بضبط معاملات الاستحواذ كما تم تحديدها في التجارب السابقة. ومن المهم تحقيق دقة مناسبة دون حدوث تبييض ضوئي، لأن ذلك يسبب تلف الخلايا ويعطل التقدم في الانقسام الفتيلي. اختر عدة حقول تحتوي على خلايا في مرحلة الدخول في الانقسام الفتيلي لكل حالة، وذلك للحصول على عدد كبير من الخلايا لتحليلها دون تجاوز فاصل الاستحواذ الزمني. وبمجرد اختيار جميع الحقول، أعد ضبط التركيز وابدأ عملية الاستحواذ بأسرع ما يمكن.

عند استخدام نظام المجهر البؤري ذي القرص الدوار، يتضمن الإعداد النموذجي أربعة ظروف مختلفة، وسبعة حقول لكل لوحة، وقناتين لونيّتين مع فاصل زمني يتراوح من 1.5 إلى دقيقتين على مدار فترة زمنية مدتها 75 minute. حدد معايير دقيقة لتحليل الأنماط الظاهرية للانقسام الفتيتي في الخلايا، والتي ستعتمد على العلامات الفلورية المستخدمة.

على عكس ترنسفكشن BAG3-GFP باستخدام DNA البلازميد، كما هو موضح على اليسار، يتيح الأدينوفكشن باستخدام الفيروسات الغدية المؤتلفة الموضحة هنا على اليمين تعبيراً أكثر تجانساً وكفاءة لـ BAG3-GFP في غالبية المجموعة الخلوية عند تعدد عدوى منخفض. يُظهر لطخة وسترن التمثيلية هذه أن الأدينوفكشن باستخدام siRNAs خاصة بـ BAG3 والفيروس الغدي المؤتلف BAG3-GFP يسمح باستنفاد فعال لـ BAG3 الداخلي وإعادة إدخال بروتين BAG3-GFP بمستويات قريبة من المستويات الداخلية. وكما هو موضح هنا، يمكن للأدينوفكشن أن يحافظ على التوازن البروتيني حيث لا توجد زيادة ملحوظة في مستويات بروتينات الصدمة الحرارية المستحثة بالإجهاد في خلايا HeLa التي خضعت للأدينوفكشن، على عكس خلايا HeLa المعالجة بمحفز الإجهاد السمي البروتيني MG132. نرى هنا أن تقدم الخلايا عبر الانقسام الميتوزي لا يتأثر بشكل كبير بالأدينوفكشن، كما تظهر هذه الصور الزمنية المجهرية بؤرية التركيز لخلايا HeLa التي خضعت للأدينوفكشن بـ siRNA ضابط و BacMam-GFP alpha Tubulin و BacMam-RFP Actin.

يشير الرسم البياني إلى نسبة الخلايا التي تعاني من انقسام ميتوزي غير طبيعي. أظهرت الخلايا التي تم نقل siRNA النوعي لـ BAG3 إليها وحدها زيادة تقريبية بمقدار ضعفين في مستوى عيوب الانقسام الميتوزي كما هو موضح في العمود الأحمر، وهو ما عاد إلى مستوى قريب من مستوى الخلايا الضابطة عند إعادة إدخال BAG3-GFP الموضح في العمود الأسود.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب إنقاذ الاستنفاد (depletion rescue) باستخدام تقنية adenofection. توفر هذه الطريقة نظاماً سريعاً وبسيطاً لإنشاء عمليات تثبيط جيني ناقصة (hypomorphic knock-downs) لتحليل البنية والوظيفة في خلفيات خلوية متعددة. باتباع هذه الطريقة، يمكن تحديد المتطلبات الهيكلية الرئيسية للبروتين المستهدف من أجل وظيفة معينة. ويمكن بعد ذلك استخدام مناهج أخرى لتحرير الجينوم لتعميق فهم الآليات المعنية.