تقنيات ميكرومانيبوليشن يسمح تحليل الديناميات Morphogenetic ودوران للمنظمين سيتوسكيليتال

الهدف العام من استخدام مزيج من تقنيات المعالجة المجهرية والمجهرية الضوئية مثل FRAP والتنشيط الضوئي هو مراقبة الديناميكيات المكانية الزمانية للبروتينات المشاركة في تنظيم الهيكل الخلوي والهجرة في ظروف متميزة أو بطريقة تعتمد على مسار الإشارات. تعد طرق المعالجة الدقيقة التي تمت مناقشتها هنا مفيدة للتوصيل المباشر لأي نوع من الجزيئات إلى الخلايا وكذلك للتلاعب الناجم عن الضوء بنشاط البروتين داخل مواقع دون خلوية محددة. لذا فإن الميزة الرئيسية للتقنيات المعروضة هنا هي أنها تسمح بتحديد التأثيرات اللحظية التي تمارسها البروتينات على الخلايا جنبا إلى جنب مع تتبع حركتها في جميع أنحاء الخلية.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتمرير خلايا B16-F1 المزروعة مسبقا بنسبة واحد إلى خمسة في طبق بلاستيكي يبلغ طوله ثلاثة سنتيمترات. استنشاق وسط زراعة الخلايا. اغسل الخلايا باستخدام PBS ، واستنشق PBS وأضف Trypsin EDTA لفصل الخلايا.

أضف وسط زراعة الخلايا إلى الخلايا المدرجة في التربسين. أعد تعليق الخلايا ونقلها إلى أنابيب الصقر ، بعد جهاز الطرد المركزي هذا عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. بعد وضع خلايا B16-F1 في طبق يبلغ طوله ثلاثة سنتيمترات والسماح لها بالانتشار لمدة ست ساعات على الأقل ، قم بنقل خلايا B16-F1 عن طريق إضافة خليط من 500 نانوجرام من بنية الحمض النووي وميكرولتر واحد من كاشف التعدي في محلول يحتوي على 150 مللي مولار كلوريد الصوديوم.

بالنسبة لخلايا B16-F1 ، قم بتغطية زلات غطاء 15 ملم ب 150 ميكرولتر من محلول اللامينين واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة لخلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 ، قم بتغطية زلات الغطاء بمحلول فيبرونيكتين واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الغطاء المحتضن لللامينين والفيبرونيكتين باستخدام PBS ثم استنشق PBS.

قم بزرع ملليلترين من الخلايا الليفية NIH 3T3 بنسبة واحدة إلى 20 من طبق ملتقى على زلات الغطاء المطلي بالفبرونيكتين. Pipet ملليلترين من خلايا B16-F1 المنقولة بنسبة واحد إلى 30 من طبق ملتقى على زلات الغطاء المطلي بالصمغ. بعد ذلك ، اسمح للخلايا بالانتشار على زلات الغطاء المطلي بطبقة اللامينين والفيبرونيكتين طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية قبل الفحص المجهري.

ضع زجاج الغطاء بحيث يكون جانب الخلايا لأعلى على غرفة تصوير من الألومنيوم RC-26 موصلة للحرارة. بعد ذلك ، ضع مادة مانعة للتسرب بلاستيكية أعلى زجاج الغطاء لعمل ختم آمن بين زلة الغطاء والغرفة ، وقم بإصلاحها عن طريق شد مانع التسرب البلاستيكي بمشابك منزلقة للغرفة لتجنب تسرب الوسيط. الآن ، ماصة 37 درجة مئوية وسط الفحص المجهري المسخن مسبقا في المنطقة المركزية.

أدخل كاشف الحرارة في الفتحة المخصصة للغرفة وقم بتوصيل أقطاب الغرفة بوحدة التحكم في درجة الحرارة الأوتوماتيكية TC-324B مع الحفاظ على درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي ، محلول بروتيني مذاب مسبقا عند 10 ، 000 جرام لمدة 30 دقيقة على الأقل لإزالة مجاميع البروتين التي يمكن أن تؤدي إلى انسداد الإبرة إذا كانت موجودة في الشعيرات الدموية للحقن المجهري. باستخدام طرف ماصة مرن، قم بتحميل إبرة حقن دقيقة بميكرولتر واحد من محلول البروتين من الجانب الخلفي.

في حالة وجود فقاعات هواء في طرف الإبرة ، اضغط برفق على قاعدة الإبرة لإزالتها. ثم اضبط بعناية حامل الإبرة على جهاز المعالجة الدقيقة. عند شد إبرة الحقن المجهري في حامل الإبرة ، قم بالضغط على الإبرة باستخدام جهاز ضغط الحقن المجهري قبل نقل طرف الإبرة في وسط زراعة الخلية.

بعد ذلك ، ضع الإبرة في مجال الرؤية باستخدام هدف تكبير منخفض ثم ابحث عن خلية ذات أهمية وقم بخفض الإبرة تدريجيا فوق الخلية. بالنسبة للحقن المجهري ، المس برفق غشاء البلازما للخلية ، والذي قد يكون كافيا لاختراق الخلية أو المساعدة في تمزق الغشاء العابر عن طريق النقر اللطيف جدا على إعداد المجهر. أوقف عملية الحقن بمجرد أن يكون التدفق إلى الخلية مرئيا عن طريق تحريك طرف الإبرة لأعلى في الوسط.

قبل تشغيل الليزر ، قم بالتبديل إلى قناة GFP وابدأ الحصول على الفاصل الزمني للصورة. بعد ذلك ، ارسم المنطقة المراد تبييضها يدويا على قناة GFP أثناء عرض الشاشة. ابدأ التبييض الضوئي بواسطة مشغل يدوي لليزر 405 نانومتر على الأقل من ثلاثة إلى أربعة إطارات بعد بدء الحصول على الصورة.

اضبط الحصول على صورة GFP 488 نانومتر في البرنامج على تعريض ضوئي 500 مللي ثانية وفاصل زمني 1500 مللي ثانية. بعد ذلك ، اضبط إعدادات البرنامج للحصول على أفلام الفاصل الزمني ثنائي القناة أو ثلاثية القنوات عن طريق تحديد مربع سلسلة الطول الموجي وتحديد العدد المطلوب من القنوات في قائمة الطول الموجي للاكتساب. قبل تشغيل الليزر ، ابدأ الحصول على الفاصل الزمني للصورة وارسم المنطقة المراد تنشيطها ضوئيا يدويا على قناة تباين الطور أثناء عرض الشاشة.

بعد ذلك ، ابدأ التنشيط الضوئي بواسطة مشغل يدوي لليزر 405 نانومتر على الأقل من ثلاثة إلى أربعة إطارات بعد بدء الحصول على الصورة. لتحليل نتائج FRAP ، افتح أفلام الفاصل الزمني المشتقة من VisiView على برنامج MetaMorph. اشتقاق قيم شدة المناطق المبيضة ضوئيا لكل نقطة زمنية لاستعادة التألق عن طريق رسم المناطق المعنية يدويا باستخدام MetaMorph.

ارسم شكلا عند طرف الصفيحة الصفيحية يغطي كامل أو جزء من المنطقة المبيضة ضوئيا واضبط موضعه يدويا على الإطارات اللاحقة إذا لزم الأمر من أجل تتبع التغيرات في شدة رقائقي الأرجل في المنطقة المعنية بمرور الوقت أثناء إزاحة الطرف المتقدم. لتصحيح الخلفية واكتساب التبييض الضوئي ، قم بتحليل المناطق خارج وداخل الخلايا على التوالي. بمجرد تحديد منطقة ذات اهتمام ، استخرج قيم شدتها على MetaMorph باستخدام قياسات منطقة قياس القائمة.

تأكد من تحديد خيارات الوقت المنقضي ومتوسط الشدة في قائمة التكوين. انقر فوق فتح السجل وحدد تبادل البيانات الديناميكي. ثم انقر فوق "موافق" لفتح جدول بيانات Excel وانقر فوق الزر "فتح السجل" مرة أخرى للصق قيم MetaMorph في Excel.

استخدم قيم الشدة المشتقة من MetaMorph لحساب منحنيات استرداد مضان FRAP عن طريق لصق قيم الكثافة في جدول بيانات Excel يحتوي على الصيغ المناسبة. يتم تطبيع الانتعاش الفلوري للمنطقة المبيضة الضوئية إلى الخلفية والمناطق الداخلية. لحساب نصف وقت استعادة التألق ، قم بلصق قيم منحنيات استرداد التألق مع الأوقات المقابلة في SigmaPlot ثم قم بإجراء ملاءمة منحنى باستخدام الارتفاع الأسي لمعالج الملاءمة الديناميكي إلى أقصى أداة ، واختيار وظيفة أحادية أو ثنائية الأسية اعتمادا على أفضل ملاءمة للمنحنى.

يمكن لصق المعلمات التي تم الحصول عليها عن طريق حل الوظيفة المحددة في جدول بيانات Excel يحتوي على الصيغة المناسبة التي تسمح بحساب نصف وقت الاسترداد في ثوان. لقياس انتشار الأكتين القابل للتنشيط الضوئي عند التنشيط وكذلك تراكمه داخل منطقة معينة مثل الصفيحة ، استخدم MetaMorph لتحديد الشدة بمرور الوقت في المناطق المعنية وكذلك خارج الخلية من أجل تحديد مضان الخلفية للتطبيع. لفحص المعدل الدقيق لإزاحة الأكتين القابل للتنشيط الضوئي بعيدا عن منطقة التنشيط أو معدل دمجها داخل الصفيحة ، تولد منحنيات مضان من البيانات المشتقة مسبقا من MetaMorph.

الصق قيم الشدة لمنطقة الخلفية المستخدمة لتطبيع المنطقة العصارية الخلوية المنشطة ضوئيا أو المنطقة الصفيحية المراد فحصها في جدول بيانات Excel يحتوي على الصيغ المناسبة. تظهر هنا صور تباين الوجه لخلية الخلايا الليفية NIH 3T3 قبل وبعد الحقن المجهري ل GTPase Rac1 الصغير. بعد حوالي 12 دقيقة من الحقن المجهري ، غيرت الخلية مورفولوجيتها مما يشير إلى نجاح الحقن.

يتم عرض إعادة تدوير EGFP VASP المبيض بواسطة جزيئات غير مبيضة في طرف الصفيحة هنا. في هذا المثال بالذات ، تنتشر هضاب التألق عند حوالي 80٪ من التألق قبل التبييض. عند التنشيط الضوئي ، ينتشر أكتين GFP المنشط ضوئيا بسرعة خارج منطقة العصارة الخلوية.

ينتقل جزء من مونومرات الأكتين المنشطة ضوئيا إلى الأمام مما يخلق انفجارا سريعا من التألق في الصفيحة. يكون دمج التألق أقل بشكل لذيذ في الصفيحة البعيدة عن المنطقة المنشطة ضوئيا حيث يصبح جزء مونومرات الأكتين المنشط ضوئيا مخففا بمونومرات غير نشطة في رحلتهم عبر العصارة الخلوية. عندما ينتشر الأكتين GFP المنشط ضوئيا بعيدا عن المنطقة المنشطة ضوئيا بمرور الوقت ، يتم استبداله باستمرار بالأكتين غير الفلوري غير المنشط ضوئيا.

نتيجة لذلك ، لوحظ انخفاض تدريجي في شدة التألق في هذه المنطقة. بمرور الوقت ، تدمج الصفيحة الصفائحية القريبة من منطقة تنشيط العصارة الخلوية بسرعة الأكتين الفلوري. الانخفاض التالي في التألق يرجع ببساطة إلى إزالة بلمرة الأكتين وانتشار المونومر بعيدا عن الصفيحة.

لذلك عندما يتم إجراء التجارب على نظام مجهر واحد ، يمكن إجراء الجمع بين الحقن المجهري وتقنيات FRAP أو التنشيط الضوئي بشكل واقعي في غضون بضع دقائق اعتمادا على طبيعة البروتينات التي تم فحصها. تذكر دائما أن تبقي أنفسكم سعداء قبل وأثناء وبعد المعالجة الدقيقة أو بعد التعرض لضوء الليزر. بالنسبة ل FRAP والتنشيط الضوئي ، من المهم بشكل خاص أن تحافظ المنطقة المختارة على سلامتها الهيكلية طوال مدة الفيلم.

يمكن استكمال إجراء الحقن المجهري من خلال التطبيق الموضعي للأدوية المنفذة لغشاء البلازما أو مثبطات الهيكل الخلوي من أجل معالجة العواقب الفورية للعلاجات المحددة على المستوى تحت الخلوي. مهدت تقنيات المعالجة الدقيقة الطريق لاستكشاف خصائص الانتشار والديناميكيات تحت الخلوية لمكونات ومجمعات الهيكل الخلوي وفهم المسارات المستعملة التي تنظم التشكل الخلوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تتبع ومراقبة الديناميكيات الزمانية المكانية للبروتينات العصارية الخلوية ، والبروتينات المدمجة في الفعل داخل الهيكل الخلوي أو الموجودة في عضيات مختلفة تحت الخلوية ، مما يؤدي في النهاية إلى كشف حركية تنظيم الخلية.