التوصيف المظهري لالضامة من الكلى الجرذ بواسطة التدفق الخلوي
أكتوبر 18, 2016
توضح هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة عن المظهرية والتحليل الكمي الضامة المقيمين من الكلى الفئران عن طريق التدفق الخلوي. الخلايا الملون الناتجة يمكن أن تستخدم أيضا لتطبيقات أخرى، بما في ذلك فرز الخلايا، تحليل التعبير الجيني أو الدراسات الوظيفية، وبالتالي زيادة المعلومات التي تم الحصول عليها في النموذج التجريبي.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وتوصيف البلاعم المقيمة من كلى الفئران عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن أن يكون لهذه الطريقة إجابة على سؤال رئيسي في السيولة مثل ما هي مساهمة كل نوع من أنواع الماكرافاج في إصابة الكلى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقسطرة الكلى لعلامة البروتين المختلفة. وبالتالي ، فإن الحد من السلامة الخلوية لإثبات الإجراء ستكون إيلينا أوليفاريس ، طالبة A.P.A.S.D. من جامعة كومبلوتنسي وميلانيا غيريرو ، طالبة A.P.A.S.D. من أجل نضح الكلى واستخراجها ، ابدأ بالضغط على طية صغيرة من الجلد للتأكد من أن الفئران قد وصلت إلى المستوى المناسب من التخدير. وتغطية العينين بمرهم بيطري. ضع على طاولة جراحية في وضع ضعيف. وانقع البطن مع 70 ٪ الإيثانول. بعد ذلك ، قم بعمل شق مركزي عبر جلد البطن والصفاق من العانة إلى القفص الصدري لفضح تجاويف الجنبة والبطن. استخدم نظام التروية لحقن محلول ملحي بنسبة 0.9٪ في الشريان الأورطي البطني لتنظيف الكلى. قطع الشريان الأورطي في البطن للمساعدة في إفراز الدم. عندما يتم إزالة كل الدم من الكلى، اقطع النقير الكلوي. ثم اضغط على حافة كل كلية لفك رأس الأعضاء بعناية. ونقل الكلى المستخرجة إلى H.B.S.S.To جديدة لتوليد معلق خلية كلوية واحدة ، واستخدم المقص لتقطيع نصف كلية واحدة إلى أجزاء صغيرة. انقل قطع المناديل إلى أنبوب سعة 1.5 مل وأضف 1 مل من الكولاجيناز الطازج إلى الأنبوب لمدة 30 دقيقة في 37
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً مفصلاً للتحليل المظهري والكمي للخلايا البلعمية المقيمة في كلى الجرذان باستخدام قياس التدفق الخلوي. ويمكن استخدام الخلايا المصبوغة الناتجة في تطبيقات متنوعة، مما يعزز المعلومات التي يتم الحصول عليها في النموذج التجريبي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علوم الأعصاب
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
الخلفية العلمية
- تلعب الخلايا البلعمية دوراً حاسماً في صحة الكلى وأمراضها.
- يتيح قياس التدفق الخلوي تحليلاً مفصلاً للمجموعات الخلوية.
- يمكن لفهم سلوك الخلايا البلعمية أن يوجه الاستراتيجيات العلاجية.
- تُستخدم نماذج الجرذان بشكل شائع لدراسة وظائف الكلى.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لعزل وتحليل البلاعم الكلوية.
- تسهيل إجراء المزيد من الأبحاث حول وظائف البلاعم في السياقات الكلوية.
- توفير مورد للباحثين في المجالات ذات الصلة.
الطرق المستخدمة
- قياس التدفق الخلوي لتحليل الخلايا.
- تقنيات التلوين لتحديد الخلايا البلعمية.
- بروتوكولات فرز الخلايا وتحليل التعبير الجيني.
- دراسات وظيفية لتقييم نشاط الخلايا البلعمية.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للبلاعم المقيمة من كلى الجرذان.
- توصيف تفصيلي للأنماط الظاهرية للبلاعم.
- تطبيقات محتملة في دراسات التعبير الجيني والدراسات الوظيفية.
- تعزيز فهم أدوار البلاعم في صحة الكلى.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لتحليل الخلايا البلعمية.
- يمكن للنتائج أن ترفد الدراسات المستقبلية حول أمراض الكلى.
- يمكن توسيع نطاق البحث ليشمل تطبيقات أخرى تتجاوز قياس التدفق الخلوي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعد التوصيف المظهري الدقيق للمجموعات الفرعية من الخلايا البلعمية في نماذج أمراض الكلى أمراً بالغ الأهمية لتقليل المخاطر عند التحقق من صحة الأهداف في أمراض الكلى الناجمة عن الالتهابات. يتيح بروتوكول قياس التدفق الخلوي هذا التمييز الكمي بين المظاهر المظهرية للخلايا البلعمية المحفزة للالتهابات (M1) والمنظمة للمناعة (M2) في كلى الجرذان، مما يدعم الفهم الآلي للتليف والتعديل المناعي. ومن خلال توفير طريقة موثوقة لتقييم مساهمة الخلايا البلعمية في إصابة الكلى، يعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في اختيار الأهداف قبل السريرية واستقصاء المسارات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس نسب البلعوميات M1/M2 في نماذج إصابات الكلى.
- القيمة التشغيلية: تستخدم تحديد البوابات المزدوج للتعبير عن CD45/CD68 مع صبغ السطح بـ CD86/CD163 لتحديد الأنماط الظاهرية للبلعوميات بخصوصية عالية.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر المتعلقة بالأهداف العلاجية من خلال ربط حالات استقطاب البلعوميات بالتليف ومسارات التنظيم المناعي.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج مخرجات كمية ومعيارية لقياس التدفق الخلوي لتردد الخلايا البلعمية والتعبير عن العلامات.
- قابلية التكرار: تُظهر انخفاضاً في معدل موت الخلايا مع الحفاظ على سلامتها، مما يتيح قراءات نمط ظاهري متسقة عبر التجارب المختلفة.
- الفائدة اللاحقة: تظل الخلايا البلعمية المعزولة حيوية لفرز الخلايا، وتحليل mRNA والبروتين، مما يدعم المتابعات القائمة على الأوميكس المتعددة.
الأبحاث الانتقالية والسريرية الأولية
- الأهمية المرضية: قابلة للتطبيق بشكل مباشر على نماذج أمراض الكلى الالتهابية حيث تقود الأنماط الظاهرية للبلاعم عملية التمرض.
- الاستمرارية الانتقالية: يمكن للبيانات الظاهرية المستمدة من البلاعم المفروزة أن تدعم اكتشاف المؤشرات الحيوية والتحقق الوظيفي في الدراسات قبل السريرية.
- القرارات المعدلة حسب المخاطر: تتيح تقييماً موضوعياً لتأثيرات المركبات المعدلة للمناعة على استقطاب البلاعم.
تكامل مسار العمل وتدفق العمليات
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى التقييم قبل السريري، حيث توفر قراءات مناعية تساهم في تحسين المركبات الرائدة ودراسات آلية العمل في نماذج أمراض الكلى.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات المتعلقة بالمسارات التي تحفزها الخلايا البلعمية في الإصابة الكلوية من خلال التحديد الكمي للنمط الظاهري.
- الفحص: توفر بيانات كمية قابلة للتكرار عن الخلايا البلعمية، وتكون مناسبة للتحقق من صحة المقايسات وحملات فحص المركبات.
- التحليلات: تقدم قراءات قياس التدفق الخلوي متعددة المعلمات (CD45+/CD68+/CD86+ لـ M1؛ و CD45+/CD68+/CD163+ لـ M2) مما يسمح بإجراء تحليل مقارن بين المجموعات.
- الأبحاث الانتقالية: تربط تحديد النمط الظاهري للخلايا البلعمية بالمقايسات الوظيفية اللاحقة وتوصيف التعبير الجيني في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تضع سير عمل معياري لتحديد النمط المناعي يمكن تطبيقه عبر نماذج متعددة لأمراض الكلى والمجالات العلاجية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في إصابة الكلية التي تتوسطها الخلايا البلعمية من خلال تمكين التمييز المظهري الدقيق.
- القيمة التشغيلية: يوفر عزلًا وتلوينًا معياريًا للخلايا البلعمية بتباين منخفض، بما يتوافق مع مرافق قياس التدفق الخلوي المركزية.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المضي قدمًا أو التوقف من خلال ربط تعديل الهدف بتحولات قابلة للقياس في استقطاب الخلايا البلعمية.
- التأثير على المحفظة: يدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمرشحات المعدلة للمناعة بناءً على تعديل المظهر الظاهري للخلايا البلعمية في النماذج قبل السريرية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تعويض قياس التدفق الخلوي، واستراتيجية تحديد البوابات (gating strategy)، والتحقق من صحة مؤشرات البلاعم.
- يعتمد على توفر معدات الهضم بالكولاجيناز وبنية تحتية معقمة لمعالجة الخلايا.
- يستلزم توحيد لوحات الأجسام المضادة وضوابط الفلورية عبر المواقع المختلفة لضمان إمكانية تكرار قياس كمية M1/M2.
- قد يتطلب التكيف مع أنسجة أخرى تحسين إنزيمات التفكيك ولوحات المؤشرات.
- يقتصر بسبب توافر مؤشرات البلاعم الخاصة بالجرذان (CD86, CD163) مقارنة بالمجموعات الأكثر شمولاً المتاحة للفئران.
