تعديل التقييم الأولى لجسم-يصرف مع الببتيدات المشتقة من الفيروسية لزيادة تراكم الخلوية وتحسين استهداف الورم

الهدف العام من هذه الإجراءات هو تقييم خصوصية وفعالية اقترانات الأجسام المضادة للتراكم داخل الخلايا والأورام المستهدفة خلال مراحل التطور الأولية بحيث يمكن استخدامها في النهاية في العيادة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي حول الإجابة على الحقول المترافقة ، مثل كفاءة التوطين النووي والتراكم الكلي بين الخلايا. تتمثل إحدى مزايا هذه التقنية في أنه من خلال التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، يمكن للباحثين تقييم فعالية وانتقائية اقتران الأجسام المضادة المرشحة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنيات نحو علاج وتشخيص السرطان ، لأن تراكم الخلايا السرطانية غير الفعال هو قيد رئيسي مع هذه التطبيقات لاقتران الأجسام المضادة. بعد تصنيع مترافق الجسم المضاد لتسلسل التوطين النووي لحمض المغص وفقا لبروتوكول النص ، عالج خلايا TF1A المستهدفة ب 200 نانومولار 7G3 مترافق الجسم المضاد لحمض المغص MLS. قم بتضمين الخلايا المعالجة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة المعدلة.

احتضان خمس مرات 10 إلى الخلايا السادسة إيجابية المستضد مع المترافقات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم قم بإزالة المادة الطافية ، واستخدم ملليلترا واحدا من PBS المثلج لغسل الخلايا ثلاث مرات. أضف وسطا جديدا ، واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إضافية.

بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من PBS ، الذي يحتوي على 0.25٪ من التربسين و EDTA ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 30 دقيقة. ثم استخدم 1.5 مل من وسط RPMI1640 مع 10٪ FBS لتحييد التربسين. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة جم لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، واستخدم 0.5 مل من PBS المثلج لغسل الخلايا ثلاث مرات مرة أخرى.

أضف 0.5 مل من 1٪ PFA و 1٪ سكروز و PBS إلى الخلايا ، وضعها على الجليد لمدة 30 دقيقة لإصلاحها. ثم استخدم 0.5 مل من PBS المثلج لغسل الخلايا ثلاث مرات ، وقم بالطرد المركزي للعينات عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 0.15٪ Triton X-100 و PBS إلى الخلايا ، وقم بنفغلها على الجليد لمدة خمس دقائق.

ثم ، باستخدام PBS المثلج ، اغسل الخلايا ، وكرر الطرد المركزي. قم بتعليق الخلايا في 0.1 مل من PBS ، والتي تحتوي على ميكروغرامين لكل ملليلتر من الجسم المضاد متعدد النسيلة الثانوي FC المضاد للانعكاس المقترن ب Alexa Fluor 647 ، واحتضان العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. الطرد المركزي للخلايا عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق ، واستخدم 0.5 مل من PBS المثلج لغسل الخلايا ثلاث مرات.

ثم الخلايا في 0.5 مل من PBS. أضف 10 ميكروغرام لكل مليلتر من يوديد البروبيديوم إلى الخلايا. ثم استخدم وسيط التثبيت لتركيب 1 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة على شرائح زجاجية قبل تغطية العينة بقلة غطاء زجاجي.

افحص الخلايا باستخدام هدف غمر الزيت Plan APO 60X ، الفتحة العددية 1.42 ، على مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر. اكتشف مضان PI باستخدام ليزر الأرجون 488 نانومتر ومنشور المسح الطيفي الذي تم ضبطه من 600 إلى 650 نانومتر. بالنسبة لمضان AF 647 ، استخدم ليزر الهيليوم النيون 633 نانومتر ومنشور المسح الطيفي الذي تم ضبطه من 650 إلى 700 نانومتر.

اجمع الصور من PI و AF 647 بالتتابع ، 1024 × 1024 بكسل ، مع متوسط خط 2X ، تم التقاطها على فترات 0.5 ميكرون عبر سمك الخلية بالكامل. عرض الصور كإسقاطات Z. لتحليل الخلايا ، قم بتقييم وتسجيل ما إذا كان التألق داخل الخلايا في السيتوبلازم مجمعا وبالقرب من سطح الخلية أو منتشر ومتجانس.

أيضا بتقييم شدة التألق النسبية لكل خلية. بعد تحضير وتركيز الأجسام المضادة لحمض المغص NLS الملصقة بالإشعاع وفقا لبروتوكول النص ، حدد كفاءة وضع العلامات الراديوية عن طريق تطبيق 0.5 ميكرولتر من سترات الصوديوم PH5.5 0.1 مولار ، أو مادة ITLC ، على شريط ITLC. قم بتشكيل صورة شعاعية للشريط ، واحصل على صورة رقمية.

إجراء قياس الكثافة للحصول على نسبة النحاس 64 المرتبط والمجاني. إذا كان محتوى النحاس 64 الحر أكبر من 5٪ ، فقم بتركيز العينة بشكل أكبر. بالنسبة لدراسات التراكم الخلوي للنحاس 64 ، عالج الخلايا التي تحتوي على 100 نانومولار من النحاس 64 مقترن A14 عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وست و 24 ساعة ، كما هو موضح سابقا.

عالج الخلايا ب A14 غير المعدل لمنع الخلايا الأبجدية IL5R وعند أربع درجات مئوية لمنع الاستيعاب بوساطة المستقبلات. بعد غسل الخلايا واحتضانها بوسط جديد ، كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، أضف 0.5 مل من PBS الذي يحتوي على 0.25٪ من التربسين و EDTA ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم ، بعد تحييد الخلايا وغسلها كما كان من قبل ، أضف المخزن المؤقت لتحلل غشاء البلازما إلى الخلايا ، واحتضنها على الجليد لمدة 10 دقائق.

الطرد المركزي للخلايا المحللة بغشاء البلازما عند 90 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وانقله إلى أنبوب جديد. هذا يمثل الجزء السيتوبلازمي.

ثم استخدم PBS المثلج لغسل النوى ثلاث مرات ، وأضف الغسالات إلى الجزء السيتوبلازمي. تأكد من إغلاق القوارير التي تحتوي على الكسور النووية والسيتوبلازمية ، ثم ضعها في عداد جاما معاير ل Copper-64 من أجل تحويل الأعداد الأولية إلى megabecaril. تحديد جودة عزل النوى عن طريق إجراء تحليل اللطخة الغربية ل lamin AC ، وهو بروتين نووي مقيد ؛ و Rab-7 ، وهو بروتين سيتوبلازمي وفير ، على كسور محللة بالجملة ونواة وسيتوبلازمية.

عالج خمس مرات 10 للخلايا الست باستخدام 500 ميكرولتر من مقايسة الترسيب الأميني الإشعاعي ، أو المخزن المؤقت RIPA ، والمخزن المؤقت لتحلل غشاء البلازما الذي يحتوي على 1٪ 2٪ و 4٪ NP-40. علاوة على ذلك ، عالج النوى المعزولة ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA للحصول على بروتينات نووية معزولة. أضف أربعة أضعاف حجم عينة الأسيتون البارد إلى البروتينات النووية والسيتوبلازمية والبالجملة المعزولة ، واحتضن لمدة 60 دقيقة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

الطرد المركزي للعينات عند 13 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية ، مع الحرص على عدم إزاحة حبيبات البروتين. ثم أضف 100 ميكرولتر من PBS لإذابة البروتينات.

بعد إجراء Western Blotting كما هو موضح سابقا ، قم بقطع الغشاء إلى نصفين عند علامة الوزن الجزيئي التي يبلغ 40 كيلو دالتون. استخدم الأجسام المضادة الخاصة ب lamin-AC لاستكشاف اللطخة التي تحتوي على البروتينات ذات الوزن الجزيئي الأعلى ، واستخدم الأجسام المضادة الخاصة ب Rab-7 لاستكشاف النصف السفلي من الغشاء. في المجموعات التي تحتوي على أربعة فئران من العقدة ، قم بحقن 20 إلى 30 ميكروغراما في الوريد الذيل من الأجسام المضادة لحمض المغص A14 NLS المقترنة بالإشعاع ، والمسمى بإشعاع A14 NLS ، والمسمى بالإشعاع A14.

في نفس اليوم ، ضع شبحا أسطواني يحتوي على خمسة ميغابيكاريل من النحاس -64 في الماسح الضوئي PET لتحويل الأعداد المشعة في الثانية إلى جرعة محقونة لكل جرام من الأنسجة. بعد 48 ساعة ، بعد تخدير الفئران وفقا لبروتوكول النص ، انقل الماوس بسرعة إلى طاولة ماسح ضوئي للبيزتروني في وضع الانبطاح أولا مع مخروط الأنف للإيزوفلوران. ابدأ الحصول على بيانات PET باستخدام إعداد وضع أخذ العينات العادي ونافذة طاقة من 250 إلى 650 كيلو إلكترون فولت.

بعد الفحص ، قم بإزالة الماوس من الماسح الضوئي ، ثم ضعه مرة أخرى في القفص. كما هو موضح في هذا الشكل ، تظهر الأسهم الفرق عند تقييم تراكم الأجسام المضادة المترافقة مع التربسين وبدونه. في الخلايا غير المثقببة ، يصعب تقييم التراكم والتوزيع داخل الخلايا بسبب الإفراط في التعبير عن المستقبلات السطحية للخلية المستهدفة.

تظهر الأسهم الفرق في التراكم داخل الخلايا وتوزيع اثنين من الأجسام المضادة المترافقة عندما يتم تربسين الخلايا بشكل صحيح. يظهر اقتران الأجسام المضادة لحمض المغص A14 NLS الإشعاعي تقاربا نانومولا ل IL5R ألفا. مع زيادة تركيزات الأجسام المضادة لحمض المغص A14 NLS المترافقة ، اقترب الارتباط المحدد لمتقارب الأجسام المضادة لحمض المغص A14 NLS من التشبع بتركيزات 3.5 نانومولار في كل من خلايا HT-1376 و HT-B9.

يكشف عد جاما أن زيادة النشاط الإشعاعي في النواة وفي السيتوبلازم من الأجسام المضادة لحمض المغص A14 NLS المترافق للإشعاع محددة وتزداد بمرور الوقت. تم تحضين خلايا HT-1376 و HT-B9 بمحلول تحلل غشاء البلازما يحتوي على 1٪ 2٪ أو 4٪ NP-40. بالنسبة لخلايا HT-1376 و HT-B9 ، لم يتم اكتشاف المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على واحد أو 2٪ NP-40 Rap-7 في الجزء النووي ، ولم يتم اكتشاف lamin AC في الجزء السيتوبلازمي.

يسمح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني بتقييم مترافقات الأجسام المضادة المرشحة لقدرتها على استهداف الأورام الإيجابية للمستضد ، والسهام الحمراء والزرقاء ، وخصائص التوزيع الحيوي المرتبطة بها مقارنة بالجسم المضاد الأبوي غير المعدل بالببتيد. يمكن للمرء أن يرى تراكم الإشارة في الورم للمساعدة في تحديد إمكانية اقتران الأجسام المضادة المتطورة. يسمح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني أيضا بتقييم امتصاص الأجسام المضادة المتقارنة المرشحة في الأنسجة السليمة مثل الكبد.

بعد إتقان هذه التقنيات ، سيتمكن الباحثون في مجال توصيل الورم المستهدف للحمولات الجزيئية من استكشاف عوامل إضافية حيث يتم إعاقة تراكم الخلايا السرطانية بسبب انحباس الجسيمات الداخلية.