تحليل إنهاء النسخ عن طريق النسخ على تشغيل (TRO) نهج BrUTP حبلا محددة

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة إنهاء النسخ بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي إلى الخميرة الناشئة في ظل ظروف في الجسم الحي عن طريق تشغيل النسخ الخاص بالخيط عند النهج. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي حول ما إذا كان البوليميراز النشط النسخي الذي تم اكتشافه خارج الطرف الرئيسي الثلاثة للجين هو الذي بدأ من منطقة المحفز. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها يمكن أن تميز MRNA الذي ينسخ البوليميراز من البوليميراز النسخ المنتشر والذي بدأ النسخ وسيكون في الطرف الرئيسي الثلاثة للجين.

يمكن توسيع هذه التقنية لدراسة إنهاء النسخ بواسطة بوليميرات الحمض النووي الريبي والخميرة الأخرى بسبب طبيعة الحفاظ على الإنهاء بواسطة البوليميرات المختلفة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للدور الدقيق لعوامل الإنهاء في دورة نسخ الخميرة ، إلا أنه يمكن أيضا توسيعها لدراسة الإنهاء في حقيقيات النوى الأعلى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من نفاذية الخلايا وتشغيل النسخ عند التوقفات ، لأنها تتطلب تنفيذا دقيقا ، وقد يكون من الصعب أيضا تنقية النصوص الوليدة.

خطرت لنا لأول مرة فكرة هذه الطريقة من نهج البحث GRO الذي يعطي لمحة واسعة عن الجينوم لموضع البوليميرات النشطة نسخيا بطريقة محددة للخيوط. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب إجراء تشغيل النسخ وتنقية الحمض النووي الريبي بسبب الكمية المنخفضة والطبيعة غير المستقرة للنصوص الوليدة. قبل بدء النسخ ، قم بتشغيل التفاعل ، وتنمو ، وحصادت ، ونفاذة خلايا الخميرة التي تنمو بشكل كبير ، للحصول على منصة نقالة خلية نفاذة.

لبدء التفاعل ، أضف 150 ميكرولترا من النسخ ، قم بتشغيله على المخزن المؤقت إلى لوحة الخلايا المنفذة. باستخدام طرف P-200 مقطوع ، امزج برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ضع العينة على الثلج.

بعد إعادة تعليق جميع العينات في تشغيل النسخ على المخزن المؤقت ، احتضان العينات لمدة خمس دقائق عند 30 درجة مئوية في حمام مائي. أوقف التفاعل عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الكاشف البارد الجاهز للاستخدام لعزل الحمض النووي الريبي إلى كل عينة. احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ابدأ إجراء استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض إلى كل معلق خلية ورجها بقوة في خلاط دوامة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد 20 دقيقة ، استخدم إبرة ساخنة قياس 22 لثقب الجزء السفلي من كل أنبوب طرد مركزي دقيق ووضع الأنبوب أعلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية ونقل محللة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

أضف 500 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي البارد ، و 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى محللة الخلية. امزج المحتويات الموجودة على الخلاط الدوامي ثم جهاز الطرد المركزي على حرارة 16 ، 168 مرة جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

أضف كمية متساوية من كحول الفينول الكلوروفورم الأيزوأميل. رج العبوة بقوة على الخلاط الدوامي ثم جهاز الطرد المركزي عند 16 ، 168 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

أضف كمية متساوية من الفينول البارد وكلوروفورم وإيزوأميل الكحول والدوامة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. أضف إلى الحمض النووي الريبي النهائي الذي يحتوي على الطور المائي حجما مناسبا من مخزون كلوريد الصوديوم المكون من خمسة مولار للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.3 مولار. أضف ثلاثة أضعاف حجم الإيثانول البارد لترسيب الحمض النووي الريبي.

احتضن لمدة ساعة واحدة ، أو طوال الليل ، عند 20 درجة مئوية. عندما يتم ترسيب الحمض النووي الريبي ، قم بعمل جهاز طرد مركزي عند 16 ، 168 مرة G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق لوحة الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من ماء DEPC.

استخدم مجموعة عزل الحمض النووي الريبي لفصل الحمض النووي الريبي عن نيوكليوتيدات البروموريدين ثلاثي الفوسفات غير المدمجة وتخلص الحمض النووي الريبي من العمود ب 100 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي. احتضان الحمض النووي الريبي في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم انقله إلى الثلج لمدة دقيقتين على الأقل.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد حبات DU المضادة للبرومو أثناء ترسيب الحمض النووي الريبي. لكل عينة ، أضف 500 ميكرولتر من 0.25 × فوسفات الصوديوم الملحي EDTA إلى 25 ميكرولتر من الخرز المستقر. جهاز طرد مركزي عند 200 مرة G لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية.

اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت الملزم. بعد إزالة المادة الطافية من الغسيل الثالث ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع إلى الخرزات ورجه برفق لمدة ساعة إلى ساعتين عند أربع درجات مئوية على شاكر المنصة. اغسل الخرزات مرتين أخريين باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.

قم بإزالة المادة الطافية من الغسيل الثاني وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم إلى الخرز. انقل 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مباشرة إلى الخرز. احتضن مع الرج اللطيف لمدة ساعة إلى ساعتين عند أربع درجات مئوية على شاكر المنصة.

قم بالدوران عند 200 مرة جم لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية ثم قم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم إلى الخرز. قم بالدوران عند 200 مرة G لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية.

بهذه الطريقة ، اغسل الخرزات بالتتابع باستخدام مخزن مؤقت ملزم ، ومخزن مؤقت منخفض للملح ، ومخزن مؤقت عالي الملح ، ومرتين باستخدام مخزن مؤقت TET. لتصفية البروموريدين ثلاثي الفوسفات المسمى الحمض النووي الريبي من الخرز ، أضف 150 ميكرولترا من محلول الشطف واحتضنه لمدة أربع دقائق عند 42 درجة مئوية في حمام مائي. تدور لفترة وجيزة واجمع المادة الطافية.

بهذه الطريقة ، قم بشطف بالتسلسل مرتين ب 150 ميكرولتر ومرة واحدة ب 200 ميكرولتر من محلول الشطف. يجب الحصول على حوالي 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي البروموريدين ثلاثي الفوسفات المنقى من كل عينة. لترسيب التقارب ، تقارب البروموريدين ثلاثي الفوسفات المنقى المسمى الحمض النووي الريبي ، أضف 500 ميكرولتر من كحول الفينول الكلوروفورم الأيزواميل البارد إلى كل عينة.

دوامة وجهاز طرد مركزي عند 16 ، 168 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف الحجم المناسب لمخزون كلوريد الصوديوم بخمسة مولات للحصول على تركيز نهائي قدره 0.3 مولار.

ثم أضف ثلاثة أضعاف حجم الإيثانول البارد. احتضان عند 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها لترسيب الحمض النووي الريبي. في اليوم التالي ، اجمع الحمض النووي الريبي المترسب عن طريق الطرد المركزي عند 16 ، 168 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

قم بإزالة المادة الطافية واترك اللوحة تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. أعد تعليق لوحة الحمض النووي الريبي في 26 ميكرولتر من ماء DEPC. حدد تركيز الحمض النووي الريبي النهائي عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي وحصصها عند 80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها لتخليق (كدنا). تم استخدام النسخ المحدد لخيط البروموريدين ثلاثي الفوسفات الذي يتم تشغيله على النهج لاختبار متطلبات الحمض النووي الريبي 14 لإنهاء نسخ جين ASC1 في الخميرة الناشئة. تم تنقية الحمض النووي الريبي ثلاثي الفوسفات المسمى بروموريدين من الحمض النووي الريبي 14-1 المتحولة وخلاياه البرية متساوية التكوين ونسخها العكسي باستخدام البادئات C و D و E و F و G. تم تضخيم (كدنا) المقابل باستخدام أزواج التمهيدي B و C و B و D و B و E و B و G ، وتم تجزئتها على المواد الهلامية الاغاروز.

يعكس وجود منتجات مكبرة PCR مضخمة من أزواج التمهيدي B و E و B و F و B و G في الطفرة ، نمطا ظاهريا لقراءة الإنهاء. ومع ذلك ، في الخلايا البرية ، كان تشغيل النسخ على الإشارة محدودا حتى عنصر المنهي ولم يكن هناك نسخ يمكن اكتشافه على إشارة خارج منطقة المنهي. يوضح هذا الرسم البياني القياس الكمي للمواد الهلامية بخمسة S RNA كعنصر تحكم في التطبيع.

يؤكد اكتشاف النصوص الناشئة التي بدأت المروج والتي تقرأ إشارة الإنهاء في الخلايا الطافرة ولكن ليس في الخلايا البرية أن الحمض النووي الريبي 14 هو عامل إنهاء. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاثة أيام. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تشغيل النسخ عند التفاعل أمر بالغ الأهمية للحصول على نتيجة ناجحة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل البحث عن GRO من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الدور الواسع للجينوم لعامل في الإنهاء. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال النسخ لاستكشاف الإنهاء بواسطة بوليميرات الحمض النووي الريبي الأخرى في الخميرة وأنظمة حقيقية النواة العليا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء النسخ ، والتشغيل على التفاعلات وتنقية النصوص الناشئة.

لا تنس أن الحمض النووي الريبي يمكن أن يكون غير مستقر للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والحفاظ على درجة الحرارة حوالي أربع درجات مئوية واستخدام العوامل الحرة من RNAse أثناء تنفيذ هذا الإجراء.