أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم مواقع الفسفرة المحتملة المتعددة في وقت واحد وتحديد المواقع للتحقق اللاحق بواسطة طفرات موقع الفسفرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية حول دور التعديلات اللاحقة للترجمة في إشارات الخلية. تتيح هذه التقنية فحصا أوليا سهلا وصديقا للميزانية لمواقع الفسفرة والبروتين المهم.

امتدت الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص وعلاج الأمراض بما في ذلك الالتهاب والسرطان لأن الفسفرة هي حدث كيميائي حيوي مهم في مسارات الإشارات في الأمراض البشرية. سيساعد في العرض التوضيحي Sol-Bi Shin ، وهو طالب دراسات عليا من مختبري ، والذي أثناء قيامه بتوجيه الطفرات في الموقع. أولا ، اجمع بين 50 نانوغراما من البلازما pGEX JST NRF2 ، و 125 نانوغراما من التمهيدي الأمامي ، و 125 نانوجراما من التمهيدي العكسي ، وميكرولتر واحد من DNTP ، وخلط 2.5 وحدة من بوليميراز PFU DNA و 10x عازلة تفاعل على الجليد.

أضف الماء المقطر المعقم ليصل الحجم إلى 50 ميكرولترا. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لدمج الخصلة الطافرة ثم تبريد العينة على الجليد لمدة دقيقتين. أضف ميكرولتر واحد من إنزيم تقييد DPNI إلى العينة المبردة.

امزج العينة مع ماصة لطيفة ثم قم بالطرد المركزي للعينة لمدة دقيقة واحدة عند 13 ، 000 مرة G. احتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لهضم الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل للوالدين. ثم ارم خلايا الإشريكية القولونية فائقة الكفاءة مع طفرات endA1 و RACA1 على الجليد. أضف 50 ميكرولترا من خليط التفاعل إلى الخلايا المبردة واحتضنه على الجليد لمدة 30 دقيقة.

في هذه الأثناء ، سخني كتلة التسخين إلى 42 درجة مئوية. بمجرد اكتمال الحضانة ، سخني الخليط على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ثم بردي الخليط على الثلج لمدة دقيقتين. أضف مرق Lysogeny الدافئ مسبقا إلى الخلايا المحولة.

احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع رج المزيج عند 180 دورة في الدقيقة. ثم انشر الخلايا على ألواح أجار LB أمبيسلين واحتضن الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية. انقل مستعمرة واحدة إلى خمسة ملليلتر من مرق Lysogeny مع الأمبيسلين.

احتضان العينات طوال الليل عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة. استخرج عينة الحمض النووي باستخدام مجموعة إعداد صغيرة قياسية لتحليل تسلسل الحمض النووي. قم بتشغيل ما لا يقل عن 200 نانوجرام من بنية HDNA في محلل الحمض النووي للتحقق من التسلسل المتحور.

عبر عن بروتين NRF2 المتحور الذي تم التحقق من صحته وتنقيته. تحديد كمية NRF2 المتحولة المنتجة قبل إجراء فحص الكيناز. لبدء مقايسة منافسة الببتيد ، قم بإعداد محلول عازل كيناز 5X بتركيز أحادي فوسفات الأدينوزين يبلغ 500 ميكرومولار.

ثم قم بإذابة العينات المجمدة من النوع البري NRF2 البشري وثلاثة قلة الببتيد التي تحاكي مواقع الفسفرة AMPK ل NRF2. لكل ببتيد ، أثناء وجوده على الجليد ، اجمع 0.43 ملليغرام من الببتيد مع 0.15 ميكروغرام من AMPK و 0.4 ميكروغرام من NRF2 وستة ميكرولتر من 5X Kinase Buffer. أضف الماء المقطر المعقم لتحقيق حجم نهائي يبلغ 30 ميكرولترا.

ثم في منطقة محمية ، اضبط كتلة التسخين على 30 درجة مئوية. أضف ميكروكوري واحد من جاما 32P ATP إلى كل أنبوب، واخلط كل محلول جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. احتضان مخاليط التفاعل عند 30 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة.

أثناء الحضانة ، قم بإعداد 7.5٪ STS PAGE gel. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من المخزن المؤقت لعينة 10X STS إلى كل أنبوب واخلطه جيدا لإيقاف تفاعل الكيناز. قم بتشغيل العينات في الجل عند 70 فولت لمدة 20 دقيقة ثم عند 140 فولت لمدة ساعة واحدة.

عند الانتهاء من الرحلان الكهربائي للهلام ، قم بإزالة الجل عالي الإشعاع بعناية أسفل الخط الأزرق البروموفينول. انقل الجل برفق من العجلات إلى أنبوب زجاجي. ثبت الجل في محلول من 50٪ ميثانول و 40٪ ماء و 10٪ حمض الأسيتيك لمدة 20 دقيقة.

ثم ضع الجل برفق على ورق ترشيح وقم بتغطيته بغلاف شفاف. جفف الجل بمجفف جل مفرغ لمدة ساعة عند 80 درجة مئوية. تعريض الجل الجاف إما لشاشة الفوسفور أو فيلم الأشعة السينية لمدة 16 ساعة تقريبا لمدة يومين على التوالي.

استخدم Phosphorimager لإنشاء ملف TIFF أو Bitmap عالي الدقة للشاشة. لبدء فحص نشاط AMPK ، قم بإذابة عينات من AMPK والنوع المتحور والبري GST NRF2 على الجليد. اجمع بين 0.4 ميكروغرام من GST NRF2 المتحور مع 0.15 ميكروغرام من AMPK وستة ميكرولتر من المخزن المؤقت 5X Kinase.

أضف الماء المقطر المعقم ليصل الحجم إلى 30 ميكرولترا. قم بإعداد خليط تفاعل آخر بهذه الطريقة باستخدام 0.4 ميكروغرام من النوع البري GST NRF2. أضف ميكروكوري واحد من جاما 32P ATP إلى كل قارورة تفاعل.

ماصة الخلطات لأعلى ولأسفل عدة مرات ثم الطرد المركزي للمخاليط لفترة وجيزة. احتضان المخاليط عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في منطقة محمية ثم قم بإنهاء تفاعل كيناز بثلاثة ميكرولترات من عينة 10X STS المؤقتة. قم بتشغيل STS PAGE ، وقم بإصلاح الجل ، وجفف الجل باستخدام نفس شروط اختبار كيناز التنافسي.

قم بتعريض الجل لشاشة الفوسفور طوال الليل وامسح الشاشة باستخدام الفوسفوريجر. تم إجراء اختبار AMPK في المختبر في وجود ثلاثة بقايا قليلة الببتيدات 10 تحاكي مواقع فسفرة AMPK على NRF2 البشري. قدم قليل الببتيد الذي يحاكي موقع Serine 558 أكبر منافسة على فسفرة AMPK.

ثم تم تصنيع متحور NRF2 الذي حل محل Serine 558 بالألانين وتقييمه في اختبار النشاط في المختبر. لوحظ القليل جدا من فسفرة AMPK لمتحور S558 A مما يشير إلى أن AMPK يفسفرة NRF2 البشرية مباشرة في Serine 558. نظرا لأن الببتيدات ترتبط بشكل تنافسي بالبروتينات ، يمكن أيضا تطبيق مبدأ هذه الطريقة على تحديد الترجمة والتعديلات الأخرى مثل الأسيتيل وبقايا اللايسين وتفاعلات البروتين البروتيني.

لا تنس أن العمل مع النظائر الراديوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب بالفعل أخذ التدريب على سلامة النظائر الراديوية قبل تنفيذ هذا الإجراء.