بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج البروتينات بكفاءة من الصمام التاجي للقلب البشري ، وهي مناسبة للتحليل البروتيني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن الآليات المسببة للأمراض في مجال أمراض صمام القلب ، مما يسمح بتحديد علامات التشخيص والتشخيص الجديدة للأمراض ونأمل أن تكون الأهداف العلاجية. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يوفر سير عمل استخراج فعال متوافق مع العديد من التطبيقات التحليلية.

وكانت النتائج توصيفا أكثر شمولا للصمام التاجي القلبي البروتيني. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على أنظمة أخرى ، مثل الصمام التاجي الخنازير ، الذي يشبه إلى حد كبير الصمام البشري ويستخدم في النموذج التجريبي لتقييمات وظائف الصمام. ستظهر الإجراء التجريبي ستيفانيا غيلاردي ، فنية من مختبري.

لتحضير الصمام التاجي البشري ، ابدأ بقلب مزروع كان تحت نقص التروية البارد لمدة أربع إلى 12 ساعة. في غرف الأبحاث ، أخرج القلب من حقيبة النقل وضعه في دلو معقم. بعد ذلك ، انقل القلب إلى خزانة السلامة البيولوجية.

هناك ، باستخدام مشرط يمكن التخلص منه ، يتم قطعه بشكل عمودي على المحور الرئيسي على مستوى البطينين الأيمن والأيسر ، على بعد حوالي أربعة سنتيمترات من القمة. ثم ضع القلب على ستارة معقمة. بعد ذلك ، حرك الشريان الأورطي الصاعد والشريان الرئوي جانبا للوصول إلى السقف الأذيني الأيسر.

على السقف الأذيني الأيسر، استخدم الملقط والأعواد لقطع الأذن اليسرى لكشف الصمام التاجي. الصمام التاجي موجود بالكامل في البطين الأيسر. وبالتالي ، قم بفضح النشرة التاجية الكبيرة والنشرة التاجية الصغيرة.

تحدد السفارات الأمامية الجانبية والخلفية الإنسية حدود المنطقة الأمامية والخلفية. الآن ، باستخدام المقص والملقط غير المؤلم ، قم بتشريح الأذين الأيسر وسمك جدار البطين الذي يحيط بالصمام التاجي. أثناء هذا التشريح ، حدد استمرارية الصمام الأبهري التاجي.

بعد ذلك ، افصل نشرة الصمام التاجي الأمامي عن نشرة الصمام التاجي الخلفي عن طريق القطع على طول المنشورات التي تقع على حدود النشرة الخلفية. عند اكتمال الإجراء ، قم بتعقيم طاولة الخزانة بمحلول كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ ومحلول بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 6٪. الآن ، اغسل النشرة الخلفية للصمام التاجي في محلول ملحي.

ثم قم بتقطيع الصمام إلى قطع صغيرة ، كل منها أقل من سنتيمتر مربع. لف القطع بشكل فردي بورق الألمنيوم ، وقم بتجميدها بالنيتروجين السائل. لبدء استخراج البروتين ، استخدم الملقط لإزالة عينة من النيتروجين السائل ، وضعها على الفور على الثلج الجاف.

لا تدع العينة تذوب. بعد ذلك ، في قارورة ديوار مملوءة بالنيتروجين السائل ، ضع الهاون والمدقات المرتبطة بها والعينة. من الأهمية بمكان استخدام النيتروجين السائل لتجميد العينة وتبريد نظام المطحنة.

تمنع هذه الخطوة التدهور البيولوجي وتسمح بالمسحوق الفعال ، ولكنها تتطلب تدريبا تقنيا للتعامل الآمن. بمجرد تجميد الفلاش ، ضع الهاون والمدقات في صندوق من البوليسترين يحتوي على ثلج جاف. أيضا ، ضع ملعقة على الثلج الجاف.

بعد ذلك ، قم بإزالة العينة من الرقاقة وتحميلها في الهاون. ووضع المدقة الأكبر فوقها. باستخدام مفك البراغي لتدوير المدقة ، قم بطحن العينة من 15 إلى 20 مرة.

أثناء الطحن ، اخلطي العينة بطرف ملعقة مبردة. بعد استخدام المدقة الكبيرة ، كرر عملية الطحن باستخدام مدقة أصغر. يعد الحصول على مسحوق ناعم أمرا بالغ الأهمية لاستخراج البروتين بكفاءة.

الآن ، قم بتفريغ العينة المسحوقة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مللي من الكتلة المعروفة. ثم قم بتنظيف أي مادة متبقية في الهاون باستخدام ملعقة باردة. احتفظ بالأنبوب مع العينة على الثلج الجاف وحدد كتلة العينة بسرعة.

بعد ذلك ، قم بتفريغ العينة في أنبوب الخالط الزجاجي. ثم أضف 200 ميكرولتر من محلول اليوريا لكل 10 ملليغرام من العينة. عند القيام بذلك ، استرجع البقايا المتبقية في الأنبوب عن طريق شطفها باستخدام مخزن اليوريا المؤقت.

الآن قم بتجانس العينة باستخدام مدقة PFTE آلية تعمل بسرعة 1,500 دورة في الدقيقة. اضغط ببطء على المدقة على العينة بحركة ملتوية 10 مرات. بعد ذلك ، انقل المادة الطافية الصفراء اللزجة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 1.7 مليلتر باستخدام ماصة زجاجية.

كرر الآن التجانس على العينة المتبقية باستخدام نصف كمية اليوريا. استرجع المادة الطافية ودمجها مع المجموعة السابقة. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على دوار الأنبوب لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، قم بتحميل الأنبوب في جهاز طرد مركزي بارد وقم بتدوير العينة عند 13 ، 000 جم لمدة نصف ساعة. ثم استرجع المادة الطافية. وقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة بروتين برادفورد.

بعد تنفيذ البروتوكول الموصوف ، تمت دراسة مستخلص البروتين باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق بعد بعض العلاجات الإضافية. تم تحديد ما مجموعه 422 بروتينا في أنسجة الصمام التاجي عن طريق الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد ، والتركيز المتساوي الكهربي للطور السائل ، والكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي ، وقياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة ثنائية الأبعاد. تم تصنيف البروتينات البالغ عددها 422 باستخدام تحليل الأنطولوجيا الجينية.

احتوت المناطق خارج الخلية على العديد من البروتينات المتوقعة والبروتينات الأخرى داخل الخلايا وسطح الخلية. تم التعرف على العديد منها لأول مرة في الصمامات التاجية. تم تأكيد وجود أربعة من هذه البروتينات لم يتم تحديدها من قبل في الصمامات التاجية بالأجسام المضادة في ثلاث عينات فريدة.

البروتينات هي Septin-11 و Four and half LIM domains protein one و Dermatoponin و alpha crystalline B.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج البروتينات من الصمام التاجي للقلب لتحديدها وقياسها كميا. بمجرد إتقانه ، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في غضون ساعتين تقريبا إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، للحصول على أكبر إنتاجية من البروتينات ذات سلامة البروتين العالية ، من الضروري ألا تذوب العينات أثناء أي عملية نقل.