ميكروفلويديك تدفق التدفق الخلوي بواسطة غير المتماثلة الكشف الوقت تمتد المجهر الضوئي (أتوم)
يونيو 28, 2017
يصف هذا البروتوكول تنفيذ غير المتماثلة الكشف عن الوقت المجهر نظام المجهر الضوئي لتصوير خلية واحدة في تدفق فائق السرعة ميكروفلويديك وتطبيقاتها في التصوير التدفق الخلوي.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو إعداد واستخدام نظام مجهر بصري ممتد للكشف غير المتماثل عن التصوير أحادي الخلية عالي التباين الخالي من الملصقات في تدفق الموائع الدقيقة فائق السرعة. الميزة الرئيسية ل ATOM هي أنه يسمح بالتقاط صور فائق السرعة مع معدلات مسح خطي تصل إلى عشرات الميجاهرتز مع تحسين تباين الصورة على الخلايا غير المصنفة. يتيح ATOM التحليل المورفولوجي المعقد للهياكل الخلوية وتحت الخلوية باستخدام فحوصات قائمة على الخلايا غير مدخلة تصل إلى 100،000 خلية في الثانية ، وهو أمر غير ممكن مع قياس التدفق الخلوي القياسي.
لبدء إعداد النظام ، استخدم موازة ألياف لإقران فيمتو عريض النطاق أو بيكو ثانية بالقرب من الليزر النبضي بالأشعة تحت الحمراء بألياف ضوئية مشتتة أحادية الوضع متصلة بمكبر صوت بصري. قم بإضاءة درجات حيود الإرسال باستخدام الليزر لإنتاج دش طيفي. قم بتوجيه التسوية بالقرب من تكوين littrow لزيادة كفاءة الانعراج.
قم بتكوين مجموعة عدسة مرحل تلسكوبية في نظام تصوير 4f لتوجيه الدش الطيفي إلى المستوى البؤري الخلفي لعدسة موضوعية أسفل منصة العينة. تأكد من أن الدش الطيفي يملأ الفتحة الخلفية للعدسة الشيئية. ضع عدسة شيئية أخرى مع مرآة مستوية في فتحة العدسة الخلفية فوق منصة العينة.
اضبط العدسات الموضوعية حتى تتداخل مستوياتها البؤرية. تحقق من أن الدش الطيفي يمر مزدوجا بمستوى الصورة ويتبع نفس المسار مرة أخرى إلى التقدير. ضع شريحة موائع دقيقة على منصة العينة وتأكد من سقوط الدش الطيفي عبر قناة الموائع الدقيقة.
أعد توجيه الضوء المرتجع باستخدام مقسم الشعاع بعد مروره عبر التقدير. افصل الضوء المرتجع إلى شعاعين باستخدام مقسم شعاع آخر. استخدم موازاءات الألياف لربط الحزم بألياف أحادية الوضع بأطوال مختلفة لإدخال تأخير زمني بين الحزم.
قم بتوصيل الألياف براسم الذبذبات في الوقت الفعلي من خلال مقرنة ألياف وكاشف ضوئي. اضبط كسب مكبر الصوت البصري حتى تصبح نسبة الإشارة إلى الضوضاء للإشارة الضوئية أكبر من 10 ديسيبل. ثم قم بحظر ما يقرب من نصف كل شعاع تم إرجاعه باستخدام كتل شعاع حافة السكين.
اضبط كتل الحزمة حتى تصل الطاقة الضوئية المقاسة في كل ألياف إلى حوالي نصف الطاقة قبل الكتلة. تحقق من أن عرض النطاق الترددي للذبذبات ومعدل أخذ العينات مرتفعان بما يكفي لعدم التأثير على دقة الصورة. لبدء التجربة ، قم بتخفيف عينات الخلايا إلى ما بين 10 إلى 5 و 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو مياه الينابيع.
ثم قم بتحميل محلول الخلية في حقنة سعة 10 ملليلتر. قم بتوصيل المحقنة بمدخل قناة الموائع الدقيقة. قم بتوجيه مخرج قناة الموائع الدقيقة إلى أنبوب الطرد المركزي.
قم بتأمين المحقنة في مضخة حقنة واضبط معدل التدفق بشكل مناسب لعرض القناة. اختر عدد نقاط البيانات التي سيتم حفظها للتجربة. ثم احصل على بيانات الإشارة الضوئية واحفظها.
رقمنة البيانات وتصديرها من راسم الذبذبات إلى جهاز كمبيوتر. قم بمعالجة البيانات إلى صور ثنائية الأبعاد واستخرج مكتبة من المعلمات من الصور. قم باستيراد الصور الموجودة في مكتبة المعلمات إلى برنامج تصور.
قم بتعيين معلمة ذات أهمية لكل محور وحدد مجموعة البيانات المراد عرضها كمخطط مبعثر. تحقق من صور الخلايا المقترنة بكل مجموعة في المؤامرة لتحديد الاتجاهات. استخدم البوابات اليدوية أو اعرض مجموعات بيانات إضافية لمزيد من التحليل حسب الحاجة.
تم استخدام ATOM للحصول على صور خلية واحدة عالية التباين للخلايا البشرية والعوالق النباتية. تظهر هياكل الخلايا المميزة مثل الفجوات والبيرينويدات والسوط في صور العوالق النباتية. تم تحديد معلمات مثل حجم الخلية والدائرية من صور ATOM لتصنيف الخلايا لتحليل القياس الخلوي.
يمكن عرض نتائج التصنيف كمخططات مبعثرة ثنائية الأبعاد. هنا تم رسم الحجم مقابل الدائرية ل MCF7 الموضح باللون الأصفر و PBMC الموضح باللون الأحمر. لوحظت مجموعتان ل MCF7.
من خلال تحديد الصور عالية التباين المقابلة لنقاط البيانات الفردية ، وجد أن المجموعة السفلية تتوافق مع شظايا الخلايا والحطام. بمجرد إتقان نظام التصوير ، يمكن إعداده في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. يمكن إجراء إجراءات التصوير في غضون ساعة.
لا تنس إيلاء اهتمام خاص لسلامة العين أثناء العمل مع مصدر الليزر ومحاذاة شعاع الليزر. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء نظارات السلامة أثناء تنفيذ هذه الإجراءات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تذكر مراقبة محاذاة الحزمة الضوئية طوال عملية إعداد نظام التصوير بأكملها لضمان جودة التصوير المثلى.
في حين أن هذه التقنية يمكن أن تعطي نظرة ثاقبة للكشف عن الخلايا النادرة أو الظاهرة وقياسها أثناء عملية المرض ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على تصنيف نوع الخلايا ، داخل مجموعات الخلايا الكبيرة وغير المتجانسة. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عند البحث عن التغلب على قيود الإنتاجية لقياس الخلايا التصويري ، مع الحفاظ على جودة الصورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ ATOM من إعداد النظام إلى إجراءات التصوير.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول تنفيذ نظام مجهر بصري يعتمد على تمديد الوقت مع الكشف غير المتماثل (ATOM) للتصوير عالي التباين للخلايا المفردة بدون واسمات في التدفقات المائعية الدقيقة فائقة السرعة. يسمح نظام ATOM بالتقاط الصور بسرعة فائقة ويعزز تباين الصور في الخلايا غير الموصومة، مما يتيح إجراء تحليل مورفولوجي معقد.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- المجهر الضوئي
- تصوير الخلية الواحدة
- الموائع الدقيقة
الخلفية العلمية
- تتيح تقنية ATOM التصوير بمعدلات مسح خطي تصل إلى عشرات الميجاهرتز.
- تعمل التقنية على تعزيز تباين الصور للخلايا غير المصبوغة.
- تسمح بتحليل البنى الخلوية ودون الخلوية.
- تدعم المقايسات القائمة على الخلايا غير الممركزة بإنتاجية عالية.
الغرض من الدراسة
- تجهيز واستخدام نظام مجهري بصري يعتمد على تمدد الزمن للكشف غير المتماثل.
- تحقيق تصوير عالي التباين للخلايا المفردة دون الحاجة إلى استخدام واسمات.
- تسهيل التصوير في تدفق الموائع الدقيقة فائق السرعة.
الطرق المستخدمة
- يتضمن الإعداد استخدام موازٍ للألياف وليزر نبضي قريب من الأشعة تحت الحمراء.
- ربط الليزر بألياف ضوئية تشتتية أحادية النمط.
- استخدام مضخم ضوئي لتعزيز الإشارة.
- إضاءة محزز حيود إرسالي لإنتاج دش طيفي.
النتائج الرئيسية
- تحقيق تصوير لما يصل إلى 100,000 خلية في الثانية.
- إثبات تعزيز التباين للخلايا غير الموّسمة.
- تمكين التحليل المورفولوجي المعقد الذي لا يمكن تحقيقه باستخدام قياس التدفق الخلوي القياسي.
- توفير نهج جديد للتصوير عالي الإنتاجية.
الاستنتاجات
- تمثل تقنية ATOM تقدماً ملحوظاً في تكنولوجيا تصوير الخلية الواحدة.
- فهي تسمح بإجراء تحليل سريع وتفصيلي للهياكل الخلوية.
- ويمكن لهذه الطريقة أن تُحدث تحولاً في منهجيات قياس التدفق الخلوي والمجالات ذات الصلة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
تعالج تقنية ATOM القصور في إنتاجية قياس التدفق الخلوي التصويري من خلال تمكين التصوير سريع السرعة للفردية الخلوية دون استخدام واسمات بمعدل يصل إلى 100,000 خلية في الثانية، مع الحفاظ على الدقة تحت الخلوية وتباين الصور. وتدعم هذه القدرة التحليل الإحصائي عالي الموثوقية من خلال البيانات المورفولوجية متعددة الأبعاد، مما يعزز بشكل مباشر عملية التحقق من الأهداف والفحص المظهري في مراحل الاكتشاف المبكرة. ومن خلال توفير التنميط المظهري الفيزيائي الحيوي الخالي من الواسمات، تكمل تقنية ATOM المقايسات الكيميائية الحيوية وتزيد من الثقة التنبؤية في التصنيف الخلوي ضمن المجموعات غير المتجانسة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال التحليل المورفولوجي الخالي من الوسوم للبنى الخلوية وتحت الخلوية.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق من الأهداف الوظيفية عن طريق تقليل الغموض الآلي عبر التنميط المظهري الفيزيائي الحيوي عالي الإنتاجية.
- القيمة التنبؤية: تعزز فرز المحافظ الدوائية من خلال توليد معاملات مورفولوجية كمية (مثل size و circularity) للتصنيف السيتومتري لحالات الخلايا ووظائفها.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية مصادق عليها لسير العمل اللاحق من خلال تقديم صور عالية التباين وبدقة دون خلوية دون الحاجة إلى علامات أو أصباغ.
- القيمة التشغيلية: معالجة توحيد المقاييس وقابلية تكرار الفحوصات من خلال معدلات مسح خطي فائقة السرعة ومعالجة متسقة للإشارات البصرية.
- القابلية للتوسع: تسليط الضوء على الجاهزية للفحص وإمكانية إعادة استخدام المنصة عبر تمكين قياس التدفق الخلوي التصويري بمعدل 100,000 cells/s، مما يتغلب على اختناقات الإنتاجية التقليدية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يدعم الأنظمة ذات الصلة بالأمراض من خلال الكشف عن الخلايا النادرة أو الشاذة في المجموعات غير المتجانسة، كما تم إثباته باستخدام خطوط الخلايا البشرية والطحالب الدقيقة.
- المواءمة قبل السريرية: يسهل الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من خلال التصوير الخالي من الوسوم الذي يكمل المقاييس القائمة على المؤشرات الحيوية.
- قرارات معدلة حسب المخاطر: يتيح التقدم القائم على البيانات من خلال ربط الاتجاهات المورفولوجية بالنتائج الوظيفية عبر تحليل مخطط التشتت والبوابات اليدوية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يتكامل نظام ATOM ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار الفرضيات في مراحل الاكتشاف المبكرة وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة والتحقق من الصلاحية قبل السريرية، حيث يوفر تصويراً خالياً من الوسم يدعم تقليل المخاطر الآلية والتحليلات التنبؤية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تمكين التحليل المورفولوجي المعقد للهياكل الخلوية في التدفقات الموائعية الدقيقة.
- الفحص: تضمن جاهزية وقابلية تكرار المقايسات من خلال التقاط الصور عالية السرعة واستخلاص المعايير الكمية من صور الخلايا الفردية.
- التحليلات: توفر مخرجات قابلة للقياس مثل حجم الخلية، والدائرية، والقوام لإجراء التحليل المقارن والتصنيف في المخططات المبعثرة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الاستمرارية قبل السريرية عبر تمكين التصوير الخالي من الوسوم لمجموعات الخلايا غير المتجانسة، مما يدعم الفحص المظهري المستقل عن المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كمنصة قابلة لإعادة الاستخدام للتصوير عالي الإنتاجية عبر أنظمة النماذج المختلفة، مما يقلل الاعتماد على بروتوكولات الصبغ ويسرع دورات تطوير المقايسات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية من خلال تقليل المخاطر المورفولوجية الخالية من الوسم وتقليل الغموض في التصنيف الخلوي.
- القيمة التشغيلية: التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع عبر التصوير فائق السرعة والتحكم المتسق في نسبة الإشارة إلى الضوضاء (>10 dB).
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف، وكفاءة رأس المال، وتقليل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من خلال تمكين الكشف المبكر عن الخلايا النادرة أو الشاذة.
- التأثير على المحفظة: اتخاذ قرارات تحديد الأولويات والتقدم المعدلة حسب المخاطر بناءً على البيانات المورفولوجية الكمية المستمدة من التصوير عالي الإنتاجية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في المجهر الضوئي، وأنظمة الليزر فائقة السرعة، والتحكم في التدفق الموائع الدقيقة.
- يستلزم ليزر نبضي عريض النطاق بالفيمتو ثانية/البيكو ثانية في منطقة الأشعة تحت الحمراء القريبة، ومضخم ضوئي، وشبكة حيود، وراسم إشارات عالي نطاق التردد.
- يتطلب توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص محاذاة الحزمة، وحجب حافة السكين، ومعايرة طول الألياف للحفاظ على تباين الصورة والتوقيت.
- يتضمن اعتبارات التكييف لأنواع الخلايا المختلفة وأبعاد قنوات الموائع الدقيقة لضمان التغطية المثلى لل shower الطيفي.
- يشمل قيوداً عملية مثل متطلبات السلامة من الليزر والحاجة إلى محاذاة دقيقة للمسار الضوئي لتجنب تدهور الدقة.
