الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

الهدف العام لهذه المنهجية هو إنشاء أنماط بروتين مكانية نشطة بيولوجيا ثابتة تستخدم لدراسة الاستجابات الخلوية. تسمح هذه الطريقة بتلخيص الإشارات في الجسم الحي باستخدام استراتيجيات المواد الحيوية. تسمح هذه التقنية بتقليد دقيق لبعض دوافع الإشارات التي لا يمكن تحقيقها باستخدام طرق الاستزراع القياسية مثل عوامل النمو المتسلسلة وإشارات الخلايا وإشارات الخلايا والإشارات الكيميائية الحيوية المكانية المحددة.

هذا البروتوكول مهم للطرق الحالية لأنه يوفر طريقة مبسطة لضبط صلابة الركيزة ونمذجة البروتين. في حين أن هذه الطريقة يمكن أن تعزز تقنيات هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا لدراسة أنظمة أخرى مثل نمو الأنسجة ومصير الخلايا الجذعية. للبدء ، قم بإعداد حلول المخزون لمكون الهيدروجيل الرئيسي ، البولي إيثيلين جلايكول دياكريلات ، بادئ الصور ، الليثيوم فينيل -2 ، 4 ، 6-trimethylbenzoylphosphinate وبروتين ECM ، الفيبرونكتين ، في ظل ظروف معقمة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

قم بتعقيم الفلتر كل محلول باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرون قبل استخدام أو تخزين الحصص الفردية. ثم لف محلول PEG-DA بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء. لف محلول مخزون بادئ الصور بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء وقم بتخزين المحلول المحضر عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.

إذا تم تجميد محلول مخزون الفيبرونيكتين ، اترك الكمية المعقمة تذوب على الجليد لعدة ساعات أو في أربع درجات مئوية طوال الليل. ابدأ بتعقيم ورقة بوليستر واحدة لكل قالب جل. بعد ذلك ، انقع شريحتين زجاجيتين في ثلاثة فواصل بلاستيكية لكل قالب هلام في 70٪ من الإيثانول لمدة ساعتين على الأقل.

بالإضافة إلى ذلك ، انقع خمسة مشابك رابطة لكل قالب جل في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق. ضع الشرائح الزجاجية والفواصل ومشابك الموثق على لوح أوتوكلاف صغير في غطاء مزرعة الخلية للسماح لها بالجفاف في الهواء لعدة ساعات. بعد ذلك ، قم بإعداد قوالب الهيدروجيل عن طريق وضع الفواصل البلاستيكية بسمك 0.5 مم حول حافة الشريحة الزجاجية.

ضع الشريحة الزجاجية الثانية في الأعلى ثم قم بتأمين الفواصل بإحكام بجانب بعضها البعض باستخدام مشابك الموثقة. أخيرا ، قم بتعقيم القالب عن طريق وضعه في غطاء المحرك وتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. في منتصف عملية التعقيم ، اقلب القالب ليكون أكثر سوءا لفضح كلا السطحين.

قم بإنشاء محاليل سلائف الهلام كما هو موضح في الجدول الأول من بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك ، امزج أحجام PEG-DA والفيبرونيكتين وبادئ الصور معا لإنشاء الهيدروجيل. قم بعرض المحلول بقوة لضمان حل متجانس ، ولكن تجنب تكوين الفقاعات.

ماصة محلول سلائف الجل بعناية بين الشريحتين الزجاجيتين لقالب الجل. ثم ضع القالب تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وقم بتعريضه لمدة دقيقة إلى دقيقتين لتشكيل الهيدروجيل. بمجرد التبلور ، قم بإزالة مشابك الموثق وقم بإزالة الشريحة الزجاجية العلوية برفق عن طريق الضغط المعاكس على الفواصل الجانبية.

بعد ذلك ، باستخدام لكمة خزعة بحجم مناسب لقطع عينات الهيدروجيل. قم بإخراج العديد من الهلاميات المائية من مستطيل الهلام لتكون بمثابة عينات مكررة ومراقبة. عقم قناع الصورة عن طريق نقعه في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، اترك قناع الصورة يجف في الهواء في غطاء مزرعة الخلايا. بعد ذلك ، قم بوضع ماصة من ميكرولتر إلى ميكرولتر لكل سنتيمتر مربع من محلول بروتين ثيولي على سطح كل هيدروجيل مقطوع لتزيين السطح. من المهم نشر محلول البروتين على سطح الهيدروجيل بالتساوي لضمان تثبيت البروتين بشكل موحد.

ضع قناع الصورة بعناية على سطح الهيدروجيل. اضغط برفق على القناع لإزالة أي فقاعات تتشكل بين القناع وسطح الهيدروجيل. بعد ذلك ، ضع الهيدروجيل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وقم بتعريضه لجولة ثانية من ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 إلى 60 ثانية.

اغسل الهلاميات المائية باستخدام PBS لإزالة أي أنواع غير متفاعلة وضع كل هيدروجيل داخل لوحة البئر بحيث يكون سطح النمط متجها لأعلى. ثم اغسل المواد الهلامية طوال الليل في PBS عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة PBS من الآبار ، ثم أضف 250 ميكرولترا من EGM2 القاعدي في كل بئر واحتضن المواد الهلامية لمدة خمس إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.

أثناء الحضانة ، يهضم التربسين صفيحة من HUVECs شبه ملتقى في معلق خلية واحدة باستخدام التقنيات القياسية. ثم قم بتدوير تعليق الخلية وإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق حبيبات الخلية و EGM2 القاعدية بدون عوامل نمو مضافة وأضف بعضا من تعليق الخلية إلى مقياس كثافة الدم.

عد الخلايا لتحديد التركيز. بعد ذلك ، قم بتدوير اللوحة التي تحتوي على الهلاميات المائية عند 300 × جم لمدة ثلاث دقائق ، للتأكد من أن الهلاميات المائية موجودة في قاع البئر وليست عائمة. من الأهمية بمكان ألا تطفو الهلاميات المائية داخل الآبار.

ستحد الهلاميات المائية العائمة من النجاح في بذر الخلايا وتسبب مشاكل في تصوير الهيدروجيل. ماصة ببطء 75،000 خلية لكل سنتيمتر مربع على مركز كل سطح هيدروجيل حتى لا تزعج المواد الهلامية. ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.

لعدة أيام ، قم بإزالة الطبق بشكل دوري لمراقبة هجرة الخلايا استجابة لنمط البروتين. تبادل 50٪ من الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام. عند تشكيل الهلاميات المائية ، يمكن استخدام تركيزات مختلفة من السلائف PEG-diacrylate لإنتاج صلابة الركيزة المطلوبة.

كما هو موضح هنا ، يرتبط محلول 20٪ PEG-DA بصلابة أكثر من 100 كيلو باسكال. من المهم أيضا مراعاة كل من تركيز بادئ الصور ووقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية لأن الزيادة في أي من المتغيرين ستقلل من النشاط الحيوي للجزيئات المرفقة ، ممثلة هنا بالنشاط الحيوي للجسيمات الحالة. يعد تقليل التعرض للأشعة فوق البنفسجية أثناء تكوين الهيدروجيل أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على المجموعات الوظيفية الحرة من الأكريليت لتفاعلات تثبيت البروتين اللاحقة.

الهلاميات المائية المعرضة للأشعة فوق البنفسجية لمدة تزيد عن دقيقتين غير قادرة على إنشاء أنماط بروتين ثابتة موضحة باللون الأحمر. بالإضافة إلى ذلك ، مع زيادة التعرض للأشعة فوق البنفسجية لنمط البروتين ، تتفاعل المزيد من البروتينات مع السطح. عند تحضيرها بشكل صحيح ، يمكن زراعة الخلايا على ركائز الهيدروجيل المزخرفة هذه للتلاعب بسلوكها.

هنا ، تم زرع الخلايا البطانية بشكل موحد على سطح الهلاميات المائية PEG بنمط VEGF. بعد يومين من البذر ، لوحظ أن الخلايا البطانية تهاجر نحو المناطق المكانية للهيدروجيل الذي يحتوي على VEGF الثابت. بعد تطوير هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين استخدامه لشل حركة أي بروتين أو ببتيد من أجل استكشاف منصات نشطة بيولوجيا جديدة لأنظمة الخلايا في المختبر.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل تركيز بادئ الصورة ووقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية للحفاظ على النشاط الحيوي للجزيئات المجمدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقوش البروتينات والببتيدات النشطة بيولوجيا على الهلاميات المائية PEG ، وخلايا البذور بشكل موحد على الهلاميات المائية ومراقبة استجابة الخلية الناجمة عنها.