إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية ليتيح فصل آثار Mechanotransduction الإشارات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير استراتيجية بسيطة وفعالة لتثبيت أي بروتين ذي أهمية على الهلاميات المائية بولي أكريلاميد من أجل التحكم بشكل مستقل في المعلمات المختلفة للبيئة المكروية للخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نشر محلول البروتين أولا عبر سطح ختم PDMS. الخطوة الثانية هي تجفيف السطح الهيكلي لختم PDMS بعناية مع تدفق ثابت لغاز النيتروجين عالي النقاء.

بعد ذلك ، يتم وضع الختم المطلي بالبروتين بسطح منظم على اتصال بسطح الهيدروجيل المجفف ويتم تطبيق نقاط ضغط موجزة في الجزء العلوي من ختم PDMS لضمان اتصال جيد بين الميزات الدقيقة للطوابع وسطح الهيدروجيل ، والخطوة الأخيرة هي إزالة ختم PDMS برفق من سطح الهيدروجيل وتنظيف الختم بعد المناطق غير المطبوعة. مع الخلايا BSA يمكن الجلوس على سطح الهيدروجيل الصغير النمط الصغير. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الفلوري المقلوب لمراقبة ميزات البروتين الدقيقة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال التنبيغ الميكانيكي ، مثل المساهمة النسبية لخصائص المصفوفة خارج الخلية ، على سبيل المثال ، الصلابة أو كثافة ارتباط الخلية أو طبيعة البروتين. في عملية معاملة ano, فمن المستحسن أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في غطاء الدخان الكيميائي. ابدأ بوضع زلات غطاء زجاجي دائري قطرها 25 ملم في طبق بتري وتلطخ محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار عليها لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة محلول هيدروكسيد الصوديوم واغمر زلات الغطاء بالكامل في صخور DD H2O المعقمة برفق لمدة 20 دقيقة على صفيحة هزازة ، واستنزاف DDH المعقم اثنين O أضف المزيد من DDH المعقم Two O لغمر زلات الغطاء بالكامل والصخور برفق لمدة 20 دقيقة أخرى. قم بإزالة زلات الغطاء بملاقط معقمة وضعها في طبق بتري جديد. مع توجيه الجانب المنشط لأعلى ، ينزلق الغطاء بتدفق ثابت لغاز النيتروجين عالي النقاء.

بمجرد أن ينزلق الغطاء ، أعده إلى غطاء المزرعة المعقم وقم بتشويه طبقة رقيقة من ثلاثة ثلاثي ميثيل بروبيل أكرول على الجانب المنشط من كل غطاء. انزلق لمدة ساعة بعد ساعة واحدة. اغسل الغطاء الزجاجي على نطاق واسع باستخدام DD H2O المعقم.

ثم اغمر زلات الغطاء في DD H2O المعقم في طبق بتري جديد. أغلق طبق بتري بغشاء بارا وضعه على صفيحة هزاز تحت تحريك لطيف لمدة 10 دقائق. أخيرا ، استخدم ملاقط معقمة ذات أطراف دقيقة لنقل زلات الغطاء من DDH two O إلى طبق بتري جديد.

مع الوجه المنشط لأعلى. قم بتغطية الطبق بورق الألمنيوم لتجنب التصاق الغبار بزلات الغطاء وتخزينه في درجة حرارة الغرفة في مكان جاف. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد خمسة ملليلتر من محلول هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد معقم و 100 ميكرولتر من محلول الأمونيوم الطازج بنسبة 10٪ لكل كبريتات.

كما هو موضح في نص البروتوكول ، أضف 2.5 ميكرولتر من رباعي الميثيلين ديامين ، و 25 ميكرولتر من الأمونيوم لكل محلول كبريتات إلى محلول هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد. لبدء البلمرة ، امزج المحلول بثلاث ماصات متتالية دون إدخال فقاعات في ظروف معقمة تحت غطاء معقم ، ضع قطرة 25 ميكرولتر من محلول هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد على زلة غطاء دائرية مقاس 25 ملم وضع على الفور زلة غطاء زجاجي دائري مقاس 22 ملم أعلى القطرة للضغط على محلول هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد. تم تنشيط زلة الغطاء الزجاجي مقاس 22 ملم سابقا عن طريق التعرض لمدة سبع دقائق في منظف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية.

قم بتوسيط انزلاق الغطاء الزجاجي باستخدام ملاقط معقمة وقم بتنعيم أي فقاعات. اسمح لهيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد بالبلمرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اقلب يدويا محلول هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد المتبقي في الأنبوب.

لمتابعة اكتمال عملية البلمرة ، اغمر زلات الغطاء بالكامل باستخدام معقم D DH اثنين o. افصل بعناية زلة الغطاء الزجاجي مقاس 22 ملم عن طريق إدخال حافة شفرة الحلاقة بين زلة الغطاء الزجاجي 22 ملم وطبقة هيدروجيل بولي أكريلاميد الهيدروكسي بولي. اغسل هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد ثلاث مرات باستخدام PBS معقم واترك الجل مغمورا بالكامل في PBS المعقم للحفاظ على الترطيب.

تم تصنيع طوابع بولي ثنائي ميثيل سوان أو PDMS الدقيقة المستخدمة في هذا الإجراء كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع طوابع PDMS الدقيقة في محلول ماء من الإيثانول من 50 إلى 50 وصوتنة لمدة 15 دقيقة. جفف الطوابع ببخار تدفق النيتروجين وضعها في منظف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية لمدة سبع دقائق.

تحت غطاء معقم ، ضع قطرة 150 ميكرولتر من محلول البروتين المطلوب على السطح الهيكلي الدقيق ل A-P-D-M-S. يتم استخدام ختم FI nin في هذا العرض التوضيحي. انشر محلول البروتين عبر سطح الختم عن طريق تحريكه بطرف ماصة معقم باتجاه كل ركن من أركان الطابع.

اترك محلول البروتين يمتص على ختم PDMS لمدة 60 دقيقة. تحت هذا الغطاء المعقم ، أطفئ المصابيح لتجنب تلف البروتين. بعد ذلك ، انقل الغطاء المطلي بالهيدروجيل بولي أكريلاميد إلى طبق بتري جديد.

قم بإزالة PBS الزائد من سطح ركائز هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد مع تيار منخفض النيتروجين في ظل ظروف معقمة. أوقف الإجراء. بمجرد عدم ملاحظة أي دليل على وجود مياه راكدة على سطح الجل.

لا ينبغي تجفيف الجل جيدا في هذه المرحلة. جفف بعناية السطح الهيكلي لختم PDMS بتدفق ثابت لغاز النيتروجين عالي النقاء. أمسك الختم المطلي بالبروتين بملقط مناديل الضماد وضع سطحا منظما ملامسا لسطح الهيدروجيل المجفف.

قم بتطبيق نقاط ضغط موجزة مع طرف الملقط الموجود أعلى ختم PDMS لضمان الاتصال الجيد بين الميزات الدقيقة للختم وسطح الهيدروجيل ، اترك ختم PDMS على سطح الهيدروجيل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد ساعة واحدة. قم بإزالة ختم PDMS برفق من هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد باستخدام ملقط مناديل الضماد وتنظيف الختم عن طريق الزنا في محلول ماء الإيثانول لمدة 15 دقيقة. اغسل هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد المختوم على نطاق واسع عن طريق ثلاث عمليات تبادل ل PBS في ظروف معقمة لمدة 10 دقائق لكل تبادل.

بعد آخر غسل PBS ، أضف محلولا معقما من BSA واحتضنه طوال الليل عند أربع درجات مئوية تحت تحريض لطيف على صفيحة هزازة. سيؤدي ذلك إلى أكل المناطق غير المطبوعة في اليوم التالي. اغسل هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد المختوم على نطاق واسع عن طريق ثلاث عمليات تبادل ل PBS في ظروف معقمة لمدة 10 دقائق لكل تبادل.

يمكن تخزين الهلاميات المائية المختومة هيدروكسي بولي أكريلاميد عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. تظهر النتائج وجود علاقة خطية بين تطور صلابة هيدروكسي بولي أكريلاميد هيدروجيلاما وكمية صور الفلورسنت epi ذات الرابط المتقاطع لثنائي الأكريلاميد للأنماط الدقيقة المستطيلة الورقية المودعة على هيدروكسي بولي أكريلاميد هيدروجيلات من ثلاثة صلابة مختلفة توضح الضبط المستقل لهندسة النمط الدقيق وصلابة المصفوفة. يمكن تعديل كثافة ترابط الخلية عن طريق تغيير تركيز محلول البروتين المستخدم لاحتضان طوابع PDMS.

تظهر هنا صورتان فلوريتان من مطبوعات التلامس الدقيقة المتسلسلة. خطوط من الفيبرونيكتين باللون الأحمر واللامينين باللون الأخضر ، متقاطعة عند 90 درجة وخطوط الفيبرين لامينين والكولاجين مطبوعة بالتسلسل على ركيزة هيدروجيل بولي أكريلاميد 25 كيلو باسكال. عندما تم طلاء الخلايا الأولية على أسطح هيدروجيل هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد مطلية بشكل متجانس وذات نمط دقيق ، كانت صلاحية الخلية 80٪ على الأقل حتى ثلاثة أيام بعد الطلاء.

لوحظ أيضا أن الخلايا تتكاثر أكثر على ركائز صلبة مقارنة بالركائز الناعمة. عند طلاؤها على أنماط دقيقة مطلية بالفبرونيكتين مستطيلة الترسب على هيدروكسي بولي أكريلاميد هيدروكسي بثلاث صلابة مختلفة. تظهر الخلايا البطانية الأولية كثافة منخفضة من ألياف الأكتين ونواة مستديرة على اللينة.

الركائز الموجودة على ركائز أكثر صلابة وألياف الأكتين أكثر استقامة وسمكا وتشوه النواة بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال التنبيغ الميكانيكي لاستكشاف الدور الفردي لمعلمات البيئات الدقيقة للخلية في مجموعة واسعة من الأنظمة الخلوية مثل الخلايا الأولية أو الجذعية أو مستوى الأنسجة أو الكائن الحي النموذجي أو الموضة أو الديموغرافية أو أنظمة الأعضاء.