التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

يمكن أن يوفر التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء رؤى هائلة في البيولوجيا الجزيئية على النطاق الذري من خلال السماح لنا بالتلاعب بجزيئات واحدة بقوة. هنا، نُظهر قياس السرعة الثابت باستخدام مجهر القوة الذرية. يمكننا في نهاية المطاف استخدام البيانات لتحديد استقرار البروتين ، ومعدل تتكشف ، ومسار تتكشف.

لبدء الإجراء، قم بتوصيل علامة تبويب لاصقة غير موصلة إلى قرص حديدي نظيف بعرض 15 ملليمترًا. قم بإزالة ورقة الغلاف واضغط بقوة على شريحة زجاجية نظيفة أو غير مغلفة بالذهب على اللصق المكشوف. تخزين الشريحة في نظيفة، مغطاة طبق بيتري.

بعد ذلك، ركز البوليبروتين المنقى في فلتر الطرد المركزي، ثم عكس العمود والعكس البروتين في المخزن المؤقت لاستخدامه في التجربة. تحديد تركيز البروتين المناسب على أساس امتصاص في 280 نانومتر، ومن ثم إعداد 100 ميكرولتر من 100 ميكروغرام في الميلليلتر من البروتين. تطبيق 60 ميكرولتر قطرة من محلول البروتين إلى مركز الشريحة.

الحرص على عدم السماح للسائل زلة بين الشريحة والقرص الحديدي، وهذا سيؤدي إلى حركات العينة غير المنضبط خلال التجربة. دع العينة تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل. أولاً، التقط بعناية الـ"كانتليفر" في النهاية وضعه في خلية المُسبار المُحتجزة.

تأكد من أن الـ cantilever مُقعد بقوة. ثم ضع الخلية القابضة في رأس AFM. تعيين الرأس على مرحلة المجهر المقلوب وتوصيل حزمة بطارية إلى رئيس AFM لتشغيل الليزر.

قم بإعداد كاميرا للكشف عن المجهر لتصور ضوء الليزر على شاشة العرض أو شاشة التلفزيون. تسترشد المجهر، ضع الليزر بحيث يتم توجيهه إلى تلميح cantilever. مرة واحدة في العينة جاهزة، تدفق 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت التجربة في كل ميناء من خلية مسبار عقد.

decant ما يقرب من 40 ميكرولترات من السوائل من الشريحة عينة وإضافة 40 ميكرولترات من العازلة. في غضون ذلك، تبدأ إعداد مجهر القوة الذرية للقياس. أولاً، ضع الشريحة على المغناطيس فوق محرك بيزو.

تأكد من أن مرحلة AFM في وضعية مرتفعة، ثم ضع رأس AFM على المسرح مع الـ cantilever فوق قطرات العينة. بعد ذلك، ضع قطعة صغيرة من الورق أمام الصمام الضوئي AFM. اضبط الليزر حتى تصبح البقعة على الورق ساطعة ومركزة، ثم قم بإزالة الورق.

بدء تشغيل برنامج AFM لعرض إشارة من الصمام الضوئي. اضبط مرآة رأس AFM بحيث يتم تكبير إشارة الليزر في جميع رباعيات الدايود الضوئي الأربعة، وإشارة مختلفة بين أزواج الربع العلوي والسفلي هي صفر. للبدء في معايرة AFM، قم بتشغيل إعداد الفلتر لإشارة رأس AFM إلى عرض النطاق الترددي الكامل، وتأكد من إيقاف جهاز بيزو.

في برنامج AFM، قم بقياس متوسط 512 حسابًا لطيف الطاقة، مع 1,024 نقطة بيانات لكل حساب. دمج كثافة الطيفية السلطة عبر الذروة الأولى، والذي يتوافق مع الوضع الرئيسي للاهتزاز ل cantilever. بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة تحكم بيزو وتعيين عامل التصفية إلى 500 هيرتز.

تحرك بسرعة رئيس AFM أسفل بضع مئات من ميكرومترات أثناء مراقبة إشارة مختلفة. مواصلة تحريك الرأس إلى أسفل بضع مئات من ميكرومتر في وقت بينما يراقب لقفزات متسقة في إشارة مختلفة. عندما يقفز إشارة تبدأ في زيادة في الارتفاع، غيض هو قريب جدا من سطح العينة.

مرة واحدة في إشارة انحراف تشبع على اتصال تلميح مع السطح، ورفع الرأس قليلا، ثم ضبط الجهد بيزو لتحريك رئيس AFM صعودا أو إلى أسفل من قبل 100 إلى 5، 000 نانومتر للعثور على سطح العينة. بعد ذلك، إجراء تجربة سحب مع حجم مسح من حوالي 500 نانومتر بحيث الطرف اتصالات السطح، أو حوالي 100 نانومتر من السفر الحركي بيزو. استخدم النتائج لحساب ثابت الربيع و حساسيته.

في البرنامج، تعيين حجم المسح الضوئي إلى 40٪ أكبر من الحجم النظري الإجمالي للبوليبروتين تتكشف. ضع الكانتيليف بحيث يكون 80٪ من حجم المسح الضوئي بعيدًا عن السطح. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى 300 نانومتر في الثانية الواحدة.

تنفيذ تجربة سحب وقياس موقف بيزو الناتجة وإشارة الصمام الضوئي. أضف مخزن التجربة المؤقت إلى خلية السوائل كل ساعة خلال القياس للحفاظ على العينة من الجفاف. الأحداث التي تتكشف في تسجيلات لـ I91 polyprotein وبوليبروتين الذي يحيط ثلاثة مجالات I91 جزيء NI10C على كل جانب ، تم تركيبها مع نموذج سلسلة تشبه الديدان.

كل من التسجيلات تظهر القوة المميزة وزيادات الطول كفاف من I91، مما يدل على أن المعايرة AFM كانت ناجحة. وأظهرت تسجيلات البوليبروتين التي تحتوي على جزيء N110C ما يكفي من الأحداث I91 للتأكد من أن الأحداث الجديدة كانت من البروتين من الاهتمام تتكشف. وكان متوسط طول كفاف لتكرار أنكرين حوالي 10.5 نانومتر، وكانت القوات التي تتكشف بين ثمانية و 25 piconewtons.

من الضروري استخدام البوليبروتين لأن الأحداث التي تتكشف للبروتينات المرافقة توفر تحكمًا إيجابيًا لبصمات الإصبع على حدث الجزيء الواحد. وبدون ذلك، فإن البيانات عرضة لسوء التفسير.