موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)

الهدف العام من التجربة التالية هو دمج بنية DNA مرغوبة في الكروموسوم البكتيري عند موضع محدد مسبقاً. ويتم تحقيق ذلك من خلال بروتوكول تزاوج يتضمن أربع سلالات بكتيرية مهندسة. تحتوي السلالة المستقبلة على تسلسل منصة هبوط يتكون من جين مقاومة spec mycin وجين e coli beta glucuronidase محاطين بمواقع ATP مدمجة في الكروموسوم الخاص بها.

تحمل سلالة المانح P JH one 10 بلازميد يحتوي على مواقع B تحيط بجين بروتين فلوري أحمر حشو، وجين مقاومة للمضادات الحيوية. وتحمل سلالة المانح PJC two بلازميد يحتوي على إنزيم integrase محدد الموقع من عاثية streptomyces C 31 تحت تحكم محفز LAC. أما السلالة الرابعة MT 616 فتوفر جينات النقل اللازمة لعملية الاقتران لنقل البلازميدات من خلية إلى أخرى، مما يؤدي إلى إنشاء سلالات مستقبلة متحولة.

الحصول على البلازميدين المطلوبين لعملية تبادل الكاسيت بوساطة الإنزيم المدمج (integrase). يؤدي تبادل الكاسيت المانح من بلازميد PJ H one 10 مع علامات كاسيت منصة الهبوط (landing pad) على الكروموسوم إلى فقدان علامات منصة الهبوط، SPR و UIDA، والحفاظ على علامات الكاسيت المانح RFP و GMR في الكائن الناقل الناتج. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى مثل إعادة التركيب المتماثل في سهولة البروتوكول وكفاءته.

وهي قابلة للنقل أيضاً إلى مجموعة متنوعة من البكتيريا. سلالة المستقبل المستخدمة في هذا الفيديو هي سلالة S milli latte؛ قبل يومين من إجراء التزاوج لإنشاء trans integrins، يتم التلقيح من مستعمرة واحدة في 5 mL من وسط TY الذي يحتوي على spect mycin، ثم تُحضن سلالة S milli عند 30 °C لمدة يومين مع الرج. في اليوم الذي يسبق إجراء التزاوج، يتم تلقيح كل من سلالات e coli التالية في 5 mL من وسط LB السائل المضاف إليه المضاد الحيوي المناسب: سلالة DH five alpha التي تحتوي على بلازميد تعبير integrase في وسط يحتوي على tetracycline، وسلالة MT 616 المعبئة في وسط يحتوي على chloramphenicol، وسلالة DH five alpha التي تحتوي على بلازميد donor cassette في وسط يحتوي على Gentamycin. تُحضن سلالات e Coli الثلاث طوال الليل عند 37 °C مع الرج المستمر. لتحضير الخلايا لإجراء التزاوج، يتم نقل 1.5 mL من كل من المزارع الأربع إلى أنبوب، ثم تُفصل بالطرد المركزي عند 17,000 ×g لمدة 30 ثانية لجمع كتلة الخلايا، ثم يُتخلص من الوسط ويُعاد تعليق كل كتلة خلوية في 1 mL من sterile 0.85%sodium chloride. تُفصل الأنابيب بالطرد المركزي مرة أخرى، وبعد التخلص من السائل الطافي، يُعاد تعليق كل كتلة في 100 µL من sterile 0.85%sodium chloride. وباستخدام الماصة، يتم وضع 10 µL من المزرعة المغسولة لكل سلالة في نقاط منفصلة على طبق TY agar سادة.

تعتبر هذه البقع بقعاً ضابطة. بعد ذلك، أضف 40 µL من كل سلالة، باستثناء e coli DH five alpha التي تحتوي على Pjc two، في أنبوب معقم واخلطها عن طريق السحب والطرد بالماصة، ثم ضع 120 µL من هذا الخليط على طبق TY agar السادة. تمثل هذه البقعة الضابطة السلبية لغياب الإنتيجريز (no integrase).

أخيرًا، أضف 40 µL من كل سلالة من السلالات الأربع في أنبوب خلط معقم، ثم ضع 160 µL من هذا المزيج على نفس طبق أغار TDY. تمثل هذه النقطة بقعة التزاوج الخاصة بتبادل الكاسيت بوساطة الإنتيغريز (integrase mediated cassette exchange).

ضع الطبق في غطاء تدفق صفائحي واترك البقع لتجف لمدة 20 دقيقة تقريباً بعد ذلك. أغلق الطبق بإحكام واتركه في الحاضنة عند 30 درجة Celsius طوال الليل في اليوم التالي لتخطيط بروتوكول التزاوج. قم بتخطيط بقعتي التحكم وبقعة تزاوج IMCE على أطباق آغار TY المدعمة بـ streptomycin و gentamycin.

تحمل سلالة المستقبل S milli طفرة تمنح مقاومة عالية للستربتوميسين لحساب كفاءة IMCE. قم بتعليق ما يقرب من ربع بقعة تزاوج IMCE في 500 µL من كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 0.85%. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف وصولاً إلى 10⁻⁷. ازرع التخفيفات من 10⁻² إلى 10⁻⁵ على أطباق أغار TY مضاف إليها ستربتوميسين وجنتاميسين وxgl لاختيار المهاجرين العابرين (trans immigrants). ازرع التخفيفات من 10⁻³ إلى 10⁻⁷ على أطباق أغار TY مضاف إليها ستربتوميسين وxgl لاختيار كل من المهاجرين العابرين والمستقبلين المحتملين. قم بحضن الأطباق عند 30 °C لمدة ثلاثة أيام.

قم بمعاينة RFP trans تحت الضوء الأخضر ومن خلال مرشح أحمر، ثم احسب نسبة كفاءة IMCE كعدد من الوحدات المكونة للمستعمرات (CFU) للمهاجرين trans مقارنة بـ CFU لجميع المستلمين؛ حيث سيخضع نصف trans تقريبًا لتبادل حقيقي مما يجعلها بيضاء وغير حساسة بعد ثلاثة أيام من الحضن في وسط Ty المكمل بـ streptomycin و Gentamycin. يجب ألا يكون هناك نمو في سلالات الضبط التالية: no integrase control s milli latte UW 2 27 control e coli MT 616 control e coli DH five alpha containing P JH one 10 control و e coli DH five alpha containing PJC two control. وفي المقابل، يجب أن يظهر تخطيط IMCE من بقعة التزاوج نموًا متصلاً في التخطيط الرئيسي ومستعمرات عديدة في التخطيط الثاني. تُظهر الصورتان التاليتان تعليقات إعادة تعليق لتخفيف 10⁻² من بقعة التزاوج على أجار TY streptomycin xgl، وعلى أجار TY streptomycin Gentamycin xgl في وسط TY streptomycin Gentamycin xgl agar.

تمثل المستعمرات الزرقاء سلالات إعادة تركيب أحادية. بينما تمثل المستعمرات البيضاء بروتينات إنتجرين منقولة خضعت لتبادل حقيقي للكاسيت؛ وعند فحصها تحت الضوء الأخضر ومن خلال مرشح أحمر، يتبين أن التخفيف 10⁻² من معلق إعادة تعليق بقع التزاوج على أغار TY strept cin xgl يفتقر إلى الفلورة. وفي المقابل، يظهر التخفيف 10⁻² من معلق إعادة تعليق بقع التزاوج على أغار Ty streptomycin Gentamycin Xgl مستويين من الفلورة.

تتوافق المستعمرات الأكثر سطوعًا مع المستعمرات الزرقاء وتظهر تعبيرًا أعلى لبروتين RFP، ويرجع ذلك على الأرجح إلى حدوث قراءة مستمرة (read through) من محفز LAC في الناقل. أما المستعمرات الأقل سطوعًا فتتوافق مع المستعمرات البيضاء، والتي خضعت لتبادل حقيقي للـ cassette وتحتوي على RFP مع محفزه المباشر فقط دون وجود قراءة مستمرة من محفز LAC. ويُفترض أن تكون هذه المستعمرات حساسة لـ spectinomycin.

يجب أن تتراوح كفاءة التكامل العابر، والتي يتم التعبير عنها كنسبة مئوية للمهاجرين العابرين إلى إجمالي المستقبلين، في حدود 0.5%. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الاقتران البكتيري باستخدام سلالاتنا المعدلة لإدراج بنى DNA في الكروموسوم البكتيري.