تجديد ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية في الوقت الحقيقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجديد اللوحات الإلكترونية التجارية المجهزة لمحلل الخلية في الوقت الفعلي ، أو RTCA. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تجديد مجال الرقائق القائمة على الذهب التي تستخدم لمرة واحدة ، بما في ذلك تجديد الخطط الإلكترونية المستخدمة في RTCA. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء إجراء التجديد باستخدام كواشف معملية خفيفة ومتاحة بسهولة ذات سمية منخفضة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في استخدام محلل الخلية في الوقت الفعلي الذي يكلف رقائق الذهب. ابدأ هذا الإجراء بحضانة وتكاثر خلايا A549 في طبق زراعة الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف 150 ميكرولترا من وسط الخلية إلى كل بئر حضانة للوحة الإلكترونية L8. اترك الطبق لمدة 30 دقيقة في غطاء الأمان الحيوي للتوازن.

بعد 30 دقيقة ، أدخل اللوحة الإلكترونية L8 يدويا في محلل الخلية في الوقت الفعلي في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج تشغيل Real-Time Cell Analyzer على الكمبيوتر. في صفحة إعداد نمط التجربة الافتراضية، حدد نموذج التجربة، وقم بتسمية المقايسة قيد التشغيل.

في صفحة التخطيط الخاصة به، حدد الآبار المقابلة المضمنة في التجربة، وأدخل المعلومات مثل نوع الخلية وعددها وأسماء الأدوية في مربعات التحرير. في صفحة الجدول الزمني الخاصة به، أضف الخطوات التجريبية، ثم حدد وقت التشغيل لكل خطوة والفاصل الزمني للحصول على البيانات في الوقت الفعلي. انقر فوق ابدأ لقياس مقاومة خلفية الوسائط.

سيتم حفظ ملف التجربة. سيتم طرح البيانات الناتجة تلقائيا. في صفحة المؤامرة ، أضف الآبار ، وسيظهر الرسم البياني لفهرس الخلية الزمنية.

بالنسبة لتجربة انتشار الخلايا ، انقر أولا فوق زر الإيقاف المؤقت لإيقاف البرنامج مؤقتا. ثم أخرج اللوحة الإلكترونية ، وأضف 100 ميكرولتر من عازلة تعليق الخلية A549 لكل بئر في درجة حرارة الغرفة. اترك اللوحة لمدة 30 دقيقة في غطاء الأمان الحيوي للسماح للخلايا بالاستقرار في قاع آبار الحضانة.

أدخل اللوحة الإلكترونية يدويا في محطة محلل الخلية في الوقت الفعلي. ثم انقر فوق الزر "ابدأ" لمتابعة التجربة. في صفحة المؤامرة، يسجل المحلل باستمرار قيم فهرس الخلية، أو المنحنيات، طوال التجربة.

عند اكتمال التجربة، أدخل صفحة المؤامرة وافتح ملف التجربة. ثم حدد جميع آبار الحضانة المختبرة ومنحنيات مؤشر الخلية الناتجة التي يمكن متوسطها أو تطبيعها للمرة الأخيرة قبل إضافة الأدوية الصيدلانية أو تغيير الوسط لتقليل الاختلافات بين المقايسات. في صفحة تحليل البيانات ، يمكن حساب EC50 أو IC50.

بعد إجراء تقييم السمية الخلوية للأدوية المضادة للسرطان كما هو موضح في بروتوكول النص ، أخرج اللوحة الإلكترونية التي تحتوي على خلايا من محطة محلل الخلايا في الوقت الفعلي. ضع اللوحة الإلكترونية المستخدمة في شفاط أمان حيوي معقم في درجة حرارة الغرفة ، واخلط وسط الاستزراع جيدا باستخدام ماصة. ثم استخدم ماصة لشفط الوسط بأكمله.

اشطف الألواح الإلكترونية ب 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات لمدة ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة. هضم الخلايا المتبقية على الألواح الإلكترونية باستخدام 0.25٪ من التربسين المحضر حديثا لمدة ساعة إلى ساعتين في حاضنة عند 37 درجة مئوية. عند اكتمال عملية الهضم ، اعمل في شفاط السلامة الحيوية في درجة حرارة الغرفة لخلط محلول الحضانة من خمس إلى 10 مرات باستخدام ماصة ، ثم قم بإزالة المحلول.

اشطف الألواح الإلكترونية ب 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات مرتين. ثم يغسل ب 200 ميكرولتر من 100٪ إيثانول مرتين ، متبوعا بنفس الحجم 75٪ الإيثانول مرتين. أخيرا ، اشطفها ب 200 ميكرولتر أخرى من الماء منزوع الأيونات مرتين.

اقلب اللوحة الإلكترونية على شاش معقم أو مناديل ورقية لصب الماء المتبقي في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإجراء التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية على اللوحة الإلكترونية المجددة لمدة ساعة إلى ساعتين في غطاء السلامة الحيوية في درجة حرارة الغرفة. بعد استخدام الألواح لتوصيل الدواء باستخدام مادة متوسطة المسامية كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بهضم الخلايا المتبقية مع التربسين كما كان من قبل.

نظرا لاستخدام الماصة بشكل متكرر في التجارب ، يجب على الشخص الانتباه لتجنب خدش طرف وسطح الرقائق الدقيقة. اشطف الرقائق الدقيقة ب 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات مرة واحدة في شفاط السلامة الحيوية في درجة حرارة الغرفة. ثم ارفع الرقائق الدقيقة ب 200 ميكرولتر من الإيثانول المطلق مرتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، اشطف الرقائق الدقيقة ب 200 ميكرولتر من 75٪ إيثانول مرة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أضف 250 ميكرولترا من 75٪ من الإيثانول في كل بئر ، وأغلق اللوحة الإلكترونية بغشاء مانع للتسرب في درجة حرارة الغرفة. بعد تدوير اللوحة الإلكترونية عند 114 مرة G لمدة دقيقتين ، أفرغ اللوحة.

اقلب اللوحة الإلكترونية على شاش معقم أو مناديل ورقية لصب السائل المتبقي في درجة حرارة الغرفة. كرر شطف الإيثانول بنسبة 75٪ متبوعا بالدوران. ثم قم بإجراء التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية على اللوحة الإلكترونية المجددة لمدة ساعة إلى ساعتين في غطاء السلامة الحيوية في درجة حرارة الغرفة.

تقييم الخصائص البصرية لسطح اللوحة الإلكترونية المجدد عن طريق تفكيك الجزء السفلي من الحضانة أولا كما هو موضح في بروتوكول النص. لتقييم جدوى الخلايا المرفقة بعد امتصاص الأدوية المضادة للسرطان على الألواح الإلكترونية الطازجة والمتجددة ، استخدم مجهر المسح بالليزر متحد البؤر لمراقبة التألق التلقائي لجزيئات DOX التي تمتصها خلايا A549. لتسجيل التألق التلقائي ل DOX الممتص بواسطة الخلايا ، استخدم هدف الزيت 63 مرة و 485 نانومتر كطول موجي للإثارة.

بعد ذلك ، قم بتقييم السلوكيات الكهروكيميائية للأقطاب الكهربائية المتجددة عن طريق تلميع القطب الذهبي والقطب الكربوني الزجاجي أولا على سطح يشبه المرآة باستخدام إضاءة على قطعة قماش تلميع. ثم صوتنة الأقطاب الكهربائية في الماء لإزالة أي جزيئات. بعد ذلك ، قم بتنشيط قطب الذهب في حمض الكبريتيك 0.5 مولار.

الحصول على التحليل الطيفي للمقاومة الكهروكيميائية ، أو بيانات EIS ، لقطب الذهب العاري وقطب الكربون الزجاجي في محلول 10 ملليمولار من البوتاسيوم وكلوريد الإلكتروليت ، والذي يحتوي على واحد مليمولار من فيراسيانيد البوتاسيوم. الآن ، قم بإسقاط 10 ميكرولترات من تعليق الخلية على سطح القطب الذهبي في GCE. بعد إضافة الخلايا ، احتضان القطب الذهبي في GCE في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات قبل الحصول على بيانات EIS للأقطاب الكهربائية المعدلة بالخلايا ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

لتجديد الأقطاب الكهربائية ، اغمر القطب الذهبي في GCE المعدل بالخلايا في 0.25٪ تريبسين لمدة 0.5 إلى ساعتين. اشطف كلا القطبين برفق بالماء أربع مرات. ثم اشطف الأقطاب الكهربائية برفق باستخدام الإيثانول المطلق أربع مرات.

بعد ذلك ، اغمر القطب الذهبي في GCE في 75٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق تقريبا. بعد خمس دقائق ، اشطف الشريحة برفق باستخدام 75٪ من الإيثانول أربع مرات قبل الحصول على بيانات EIS للأقطاب الكهربائية المتجددة ، كما هو موضح في بروتوكول النص. لتقييم كفاءة تجديد اللوحة الإلكترونية الذهبية المصفوفة ، تم إجراء ملاحظات مجهرية لكل من الألواح الإلكترونية الطازجة والمعالجة.

لم يتم العثور على فرق افتراضي في الخصائص البصرية لسطح الرقاقة. يستخدم Throescence من جزيئات دوكسوروبيسين لتقييم حالة الخلية على الرقائق الدقيقة الذهبية قبل وبعد التجديد. أظهر التجانس المماثل والتشكل الخلوي المحدد جيدا قابلية إعادة استخدام الرقائق.

يتم تطبيق بروتوكول التجديد للاختبار الحقيقي لتكاثر الخلايا. تظهر منحنيات النمو التي تم الحصول عليها من آبار حضانة متعددة للوحة إلكترونية مختبرة تناسقا جيدا ، مما يشير إلى التجديد الناجح للرقاقة التجارية. كما هو موضح هنا ، تم اختبار اللوحة الإلكترونية المتجددة L8 لتقييم السمية الخلوية باستخدام مواد السيليكا المسامية.

انخفض مؤشر الخلية للعينة المعالجة بالمواد المسامية مقارنة بالتحكم ، مما يشير إلى سمية خلوية طفيفة للمواد. تسبب المزيد من التغليف والإفراج عن عقار دوكسوروبيسين المضاد للسرطان بواسطة مواد متوسطة المسامية في انخفاض كبير في منحنى نمو خلايا A549. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن وقت هضم نوع الحوض قد يختلف من شريحة إلى أخرى. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة أخرى مثل الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، أو حتى التحليل الطيفي ، والتحليل الطيفي للمقاومة الكهروكيميائية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تقييم تأثير التجديد.