البحوث الأساسية في الطب البلازما-نهج إنتاجية من السوائل للخلايا

الهدف العام من فحوصات التسلسل متعددة الآبار ، هو فهم تأثيرات البلازما الفيزيائية الباردة على المؤكسدات بشكل أفضل ، على الاستجابات البيولوجية في المختبر ، باستخدام التحليل الطيفي للانبعاثات الضوئية ، وتحليل السائل ، والنشاط الخلوي ، والفحص المجهري ، ومقايسات التدفق الخلوي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طب البلازما ، خاصة فيما يتعلق بالأنواع التوجيهية المشتقة من البلازما ، والتي تعتبر مهمة لتحريض موت الخلايا السرطانية المناعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي نهجها شبه الآلي.

يستخدم 96 لوحة بئر ، لزيادة سرعة وإنتاجية البحث. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاجات البلازما المستقبلية ، كما هو الحال في الأمراض الجلدية أو الأورام. ولأنها توفر الوسائل لتحديد الأنواع التوجيهية المشتقة من البلازما ، والتي تكون ذات صلة بالاستجابات البيولوجية.

سيوضح الإجراء فيليكس نيسنر ، فني من مختبرنا. لمراقبة أنواع البلازما ، ضع نفاثة بلازما في الغلاف الجوي أمام مقياس الطيف الضوئي للانبعاثات الضوئية ، عموديا على محور العمود ، واستخدم البرنامج المخصص لتسجيل الانبعاث الضوئي والطول الموجي لكل حالة غاز ، عند لترين قياسيين في الدقيقة تدفق غاز التغذية. لتحليل أكسيد فائق معالج بالبلازما ، قم بإعداد بروتوكول نهائي لجدول XYZ ، مع أوقات المعالجة المناسبة ومواقع البئر.

بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المحضر حديثا إلى آبار صفيحة 96 بئر شفافة ذات قاع مسطح في ثلاث نسخ ، واستخدم قارئ الألواح الدقيقة ، لقياس الامتصاص عند 550 نانومتر. لتحليل آثار العلاج بالبلازما على الاستجابات الأيضية للخلايا ، في غطاء التدفق الصفحي ، قم بالبذور مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الأربع ذات الأهمية في 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا المكمل بالكامل ، لكل بئر ، في صفيحة بئر مسطحة القاع 96 ، واحتضانها بين عشية وضحاها. بعد الزراعة الليلية في حاضنة زراعة الخلايا ، استخدم جدول XYZ لمعالجة الآبار بالبلازما أو الغاز وحده ، وفقا للتحليل التجريبي ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 20 ساعة أخرى.

في نهاية الحضانة الثانية ، أضف 25 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا الطازجة ، مع 500 ميكرومولار ريزازورين إلى الخلايا ، وكذلك إلى آبار التحكم في الخلفية الثلاثة Resazurin-فقط. أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة ثلاث ساعات. ثم قم بقياس التألق في قارئ لوحة صغيرة.

لتصوير الخلايا المعالجة بالبلازما ، بعد قراءة التألق ، استبدل المواد الطافية ب 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الطازجة ، مع استكمال ميكروغرام واحد لكل مليلتر من يوديد البروبيديوم. ضع اللوحة على مرحلة المجهر الآلي ، وحدد هدف 20x لتصوير الخلايا. بعد ذلك ، استخدم برنامج تحليل الصور الكمي المناسب لتحديد إجمالي مساحة العصارة الخلوية في صور تباين الطور الرقمي ، لجميع مجالات الرؤية المصورة في كل بئر.

لتحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا المعالجة بالبلازما ، بعد التصوير ، اغسل الخلايا في كل بئر مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS ، مع استكمال الكالسيوم والمغنيسيوم لكل غسلة ، متبوعا بوضع العلامات ، مع 15 جناس لكل مليلتر من الجسم المضاد أحادي النسيلة كالريتيكولين المضاد للفأر ، في 50 ميكرولتر من PBS ، بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم لكل بئر. بعد 15 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا ، اغسل الخلايا مرتين ب 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الكامل ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا إلى كل بئر لمدة 20 دقيقة ، عند 37 درجة مئوية. عندما تنفصل الخلايا ، قم بتحميل اللوحة على مقياس التدفق الخلوي ، واحصل على ما لا يقل عن 1000 حدث في مجموعة التشتت الأمامية والجانبية ، وعادة ما ترتبط بالخلايا القابلة للحياة.

بعد ذلك ، استخدم برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب لبوابة السكان محل الاهتمام ، ولتحديد متوسط شدة التألق لتعبير الكالريتيكولين. يمكن استخدام التحليل الطيفي للانبعاثات البصرية لمتابعة القمم المميزة المرتبطة بمكونات البلازما التفاعلية في ظروف غاز التغذية المختلفة. بالنسبة لمعالجة السوائل بالبلازما ، يتم تحديد التبخر الناجم عن غاز الأرجون وبلازما الأرجون أولا ، مع الظروف التي تؤدي إلى نتائج تبخر مختلفة ، حيث تمارس البلازما أيضا تأثيرات على درجة الحرارة.

على غرار نتائج التحليل الطيفي للانبعاثات الضوئية لجذور الهيدروكسيل ، ينخفض ترسب بيروكسيد الهيدروجين بشكل كبير مع خليط الأكسجين أو النيتروجين ، ولكنه يزداد مع غاز التغذية المرطب. علاوة على ذلك ، تؤدي إضافة النيتروجين إلى غاز التغذية إلى تركيزات نترات أعلى بكثير ، مقارنة بالسوائل المعالجة ببلازما الأرجون. يتم إنتاج معظم الأكسيد الفائق في ظل ظروف غاز الأرجون الجاف ، مع إضافات الأكسجين و / أو النيتروجين التي تعمل بشكل كبير على إخماد توليد الأكسيد الفائق ، باستثناء وجود بلازما أكسجين الأرجون المرطبة.

تتشابه شدة التألق للخلايا المعالجة بالريزازورين والبلازما مع التغيرات الفيزيائية التي لوحظت بصريا على المواد الطافية لمزارع الخلايا ، مما يؤكد التأثيرات السامة للخلايا للعلاج بالبلازما لفترات طويلة. لوحظ أيضا انخفاض في المساحة الإجمالية للخلية في آبار عينة معالجة البلازما ، لا سيما في ظل ظروف غاز التغذية المرطبة ، مع تنظيم عام لتلطيخ الكالريتيكولين على خلايا الورم الميلانيني ميرين ، استجابة للتعرضات القصيرة للعلاج بالبلازما. إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، يمكن إكمال فحوصات mytoplex الخلوية والقراءة في غضون ساعات قليلة فقط.

بعد هذا الإجراء ، يمكن أيضا إجراء طرق أخرى ، مثل الزراعة المشتركة مع الخلايا المناعية ، أو تحليل المواد الطافية لزراعة الخلايا. يساعد هذا في الإجابة على أسئلة إضافية ، حول إطلاق السدود أو عملاء cyto أو بروتينات التكرار ، بالإضافة إلى التعرف المناعي على خلايا الورم الميلانيني المعالجة بالبلازما. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لمزيد من البحث في دورات الورم الميلانيني ، على سبيل المثال مع كرويات الورم ثلاثية الأبعاد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء البحوث الأساسية في طب البلازما ، من مرحلة غاز البلازما ، على الجزيئات والسوائل التفاعلية ، إلى الاستجابات البيولوجية في خلايا الورم الميلانيني.