المستندة إلى صفيف "مقارنة الجينوم التهجين منصة" "الكشف عن كفاءة من نسخ عدد الاختلافات" في طفرات "سريعة النيوترون" المستحثة فصة برميلية

الهدف العام لبروتوكول التهجين الجيني المقارن القائم على المصفوفة هو تحديد الاختلافات بسرعة في عدد النسخ في الطفرات الناجمة عن القصف النيوتروني السريع لنبات البقوليات Medicago truncatula. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا البقوليات. مثل تسهيل تحديد مسببات الأمراض في الموقع المنخفض المشاركة في تنظيم نمو العقيدات في البقوليات.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ذات سمعة طيبة عالية وحساسة في الكشف عن اختلافات رقم النسخ مثل طفرات الحذف في طفرات القصف النيوتروني لنبات البقوليات Medicago truncatula. سأثبت هذا الإجراء أنا ، وهونغ تشنغ وانغ ، زملاء الطبيب المضيف من المختبر الجيني. قم بتجميد جرام واحد من أنسجة الأوراق الصغيرة التي تم جمعها من نباتات مفردة في النيتروجين السائل بسرعة.

بعد ذلك ، استخدم الهاون والمدقة وطحن أنسجة الأوراق المجمدة إلى مسحوق ناعم داخل النيتروجين السائل. استخرج عينات الحمض النووي الجينومي من النوع البري والطافرة من المسحوق الناعم باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي. استخدم 500 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي لتخفيف ميكروغرام واحد من كل نوع بري والحمض النووي الجيني المتحور بالماء المقطر المزدوج إلى الحجم النهائي البالغ 20 ميكرولترا.

ثم أضف خمسة ميكرولترات من البرايمر العشوائي إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي. قم بتدوير الأنابيب بسرعة ، وبعد دوران سريع ، ضعها في جهاز تدوير حراري لمدة 10 دقائق لتشويه طبيعة عينات الحمض النووي عند 98 درجة مئوية. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة الأنابيب من الدراجة الحرارية ، وضعها على الفور على الماء المثلج لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإعداد مزيجين من الملصقات وأضف 25 ميكرولترا من مزيج الملصقات كواحد واثنين إلى النوع البري وأنابيب الحمض النووي الطافرة على التوالي. ماصة الحمض النووي وخلط الملصقات ثلاث مرات ، ثم تدور الأنابيب لفترة وجيزة. بعد الغزل ، قم باحتضان الأنابيب في جهاز التدوير الحراري عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتعطيل إنزيم exo Klenow.

ثم أضف 430 ميكرولتر من One X TE Buffer ، واخلط المحتويات في كل أنبوب. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة ونقل المحلول في الأنابيب إلى أعمدة التنقية باستخدام أنبوبين من تجميع المليلتر. قم بالطرد المركزي لأعمدة التنقية عند 14 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق وتخلص من التدفق من خلاله.

أضف 480 ميكرولتر من One X TE Buffer إلى كل عمود ، ومرة أخرى جهاز طرد مركزي عند 14،000 مرة G لمدة 10 دقائق. تجاهل التدفق من خلال. انقل كل من الحمض النووي من النوع البري والمتحور المسمى من أسفل العمود إلى أنابيب طرد مركزي جديدة.

بعد قياس حجم كل من الحمض النووي المسمى باستخدام الماصة ، اضبط الحجم النهائي على 80 ميكرولترا باستخدام One X TE Buffer ، ثم قم بقياس تركيز الحمض النووي المسمى في مقياس الطيف الضوئي. بعد ذلك ، قم بخلط كميات مكافئة من الحمض النووي الطافرة والبرية لتهجين المجسات على شريحة مصفوفة صغيرة للتهجين المقارن. ارفع الحجم النهائي إلى 160 ميكرولتر باستخدام One X TE Buffer.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول التهجين وماصته ثلاث مرات لخلط ثلاثة عوامل جيدا مع الحمض النووي المختلط. بعد الدوران لفترة وجيزة ، قم باحتضانها في جهاز تدوير حراري عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وعند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تذكر ضبط درجة الحرارة على 67 درجة مئوية لتسخين فرن التهجين قبل أربع ساعات من التهجين.

بعد ذلك ، ضع شريحة حشية على قاعدة غرفة التهجين وقم بتحميل 490 ميكرولترا من محلول التهجين عليها بعد 20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية في الدراجة الحرارية. لتشكيل غرفة التهجين ، قم بتغطية شريحة الحشية بشريحة مصفوفة جينوم Medicago truncatula الدقيقة ، ثم قم بتغطية غرفة التهجين وشدها بإحكام باستخدام المشابك. احتضان غرفة التهجين المجمعة في فرن التهجين على حرارة 67 درجة مئوية لمدة 40 إلى 48 ساعة.

في هذه الأثناء ، قم بإعداد طبقين للغسيل مع 250 مل من Washing Buffer One المحفوظ في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اصنع طبق غسيل منزلق واحد مع Washing Buffer Two المحفوظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد جرة غسيل منزلقة واحدة مع 70 مل من الأسيتونيتريل ، وجرة غسيل منزلقة أخرى مع 70 مل من محلول التثبيت والرسم.

ضع كل من برطمانات الغسيل المنزلقة في غطاء الدخان في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة غرفة التهجين من فرن التهجين وفك مشابك الغرفة لفتح الغطاء. بعد ذلك ، قم بإزالة شريحة المصفوفة الدقيقة في شريحة الحشية وضعها على طبق غسيل منزلق باستخدام Wash Buffer One.

عزل شريحة المصفوفة الدقيقة عن شريحة الغطاء. بعد ذلك ، انقل شريحة المصفوفة الدقيقة إلى طبق الغسيل المنزلق الثاني باستخدام Wash Buffer One. باستخدام شريط التحريك ، حرك المحلول برفق على طبق تحريك مغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ضع شريحة المصفوفة الدقيقة على طبق الغسيل المنزلق باستخدام Washing Buffer Two الدافئ مسبقا ، ثم حركه بقضيب التقليب لغسل المحلول على حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة شريحة المصفوفة الدقيقة وضعها في برطمان الغسيل المنزلق الذي يحتوي على الأسيتونيتريل في غطاء الدخان لغسله لمدة 30 ثانية. انقل شريحة المصفوفة الدقيقة إلى جرة الغسيل المنزلقة بمحلول التثبيت والتجفيف واغسلها مرة أخرى لمدة 30 ثانية.

قم بإزالة الرقاقة بعناية وجففها لمدة دقيقة واحدة داخل غطاء الدخان. امسح شريحة المصفوفة الدقيقة ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي بدقة ميكرومترين. تم استخدام برنامج رسم خرائط الإشارات كواجهة لتحليل توزيع نسب السجل الطبيعي من الإشارات الطافرة مقابل الإشارات البرية عبر ثمانية كروموسومات.

بالنسبة للحذف المفترض ، يتم النظر في قيمة السجل نسبة تساوي أو أقل من سالب نقطتين خمس ، يتم النظر في الانحراف المعياري. يوضح تحليل تجزئة البرنامج ما يقدر ب 22 منطقة حذف كيلو قاعدة على الكروموسوم الرابع الموضح في الرسم البياني. يظهر تحليل حدود الحذف المحاطة بمجسات المصفوفة الدقيقة متوسط منخفض لنسبة السجل الثاني.

يظهر الرسم البياني أيضا ستة جينات مشروحة أخرى بما في ذلك جين الابن الذي يشمل المنطقة المحذوفة. جين الابن مسؤول عن التحكم في العقيدات في Metecago truncatula. بعد ذلك ، يظهر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي تم إجراؤه لتأكيد حدود الحذف منتجا بقيمة نقطة واحدة وخمسة كيلو قاعدة تم تضخيمه من طفرة FN6191 ، ولكن ليس في النوع البري.

تم إجراء تسلسل الحمض النووي لإظهار تقاطع الحذف في متحولة FN6191 الموضحة في السهم الأسود. كما تم إجراء تسلسل يؤكد موقع حدود الحذف. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون 72 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

للحصول على بيانات عالية الجودة ، تذكر أن تحافظ على تركيز الأوزون منخفضا في الغرفة التي يتم فيها إجراء الإجراء. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء مقاييس أخرى مثل تفاعلات البوليميراز المتسلسلة لجميع تسلسل الجينوم للإجابة على أسئلة إضافية مثل الحجم واختلافات رقم النسخ في الجينوم. مهد حدث هذه التقنية والتحقق من صحتها الطريق للباحثين لاستكشاف تباين عدد النسخ الذي يسببونه للطفرات والمتغيرات الطبيعية في الأنواع النباتية غير القابلة للطفرات الإدخالية مثل Garden P.لا تنس أن العمل مع محلول الأسيتونيتريل والتثبيت والتجفيف يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

الاحتياطات ، مثل ارتداء واقية العين ، وتجنب الاتصال المباشر مع الوكلاء ، والعمل بعناية أمر ضروري للغاية.