تعريف العصبية المستندة إلى شبكة الاتصال من بويضات شجيرة الماوس تنمويا المختصة أو غير كفء

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الخلايا القذائفية ذات القدرة التنموية الخلفية باستخدام أداة غير جراحية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه بمجرد مراقبة حركات البويضات التي تحدث أثناء النضج في المختبر ، يمكن للمرء تقييم إمكانات نمو الأمشاج الأنثوية. تعتمد هذه التقنية على التصوير بفاصل زمني إلى جانب قياس سرعة صورة الجسيمات ، وهو تحليل قائم على الشبكة العصبية.

هنا ، سنصف الخطوات المتخذة لإثبات أن بويضات الفئران أثناء الانتقال من المرحلة الحويصلية الجرثومية إلى المرحلة الثانية ، تظهر ملفا شخصيا مختلفا للحركات البلازمية المذكورة مرتبطة ارتباطا وثيقا بكفاءتها التنموية أو عدم كفاءتها. وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، فإن العقم هو مرض يصيب حوالي 20 في المائة من الأزواج ، بالإضافة إلى ذلك ، فإن ثلث النساء اللواتي يخضعن لعلاج السرطان معرضات لخطر فشل المبيض المبكر. هذا يتوافق مع حوالي 300 أو 000 أو 30 ، 000 امرأة في دول مثل الولايات المتحدة الأمريكية أو إيطاليا على التوالي.

شأن تصميم إجراءات غير جراحية لتحديد الكفاءة التنموية للبويضة أن يساعد على تحسين النجاح الإجمالي لنتائج الحمل. هنا ، نقدم تفاصيل عن الخطوات الأكثر أهمية للإجراء كما تم تطويره للفأر ، من أجل جعله متاحا بسهولة ليتم اختباره واستخدامه لأنواع الثدييات الأخرى مثل الأبقار أو البشر. يتم نقل المبايض في طبق بيتري يحتوي على M2 متوسط دافئ مسبقا ومتوازن و 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة ثاني أكسيد الكربون.

إذا كانت قناة البيض وبعض الدهون لا تزال موجودة حول المبيض ، فيجب إزالتها. بعد ذلك ، عند إمساك المبيض بزوج من الملقط ، يتم ثقب سطحه باستخدام إبرة معقمة 1G. تتم إزالة المبايض المثقوبة من وسط M2 ، وباستخدام ماصة دقيقة مسحوبة يدويا ، يتم نقلنا الأول إلى وسط M2 نظيف جديد ، ثم يتم سحب ماصاتنا للداخل والخارج لبضع ثوان حتى تتم إزالة الخلايا الركامية المحيطة بالبويضة تماما.

بعد ذلك ، يتم نقل البويضات في 20 ميكرولتر قطرة من وسط M2 وإذا استمرت بعض الخلايا الركامية ، تتم إزالتها تماما من خلال عدة ممرات من قطرة إلى قطرة حتى يتم التخلص من الخلايا الركامية تماما. من أجل تحضير Hoechst 33342 بتركيز نهائي قدره 0.05 ميكروغرام لكل مل ، نبدأ بمحلول خفيف من Hoechst بتركيز خمسة ملليغرام لكل مل ، محضر في PBS لمرة واحدة ويتم تخفيفه بشكل أكبر حتى يتم الحصول على التركيز المطلوب. يتم وضع 3.5 ميكرولتر قطرات صغيرة من محلول Hoechst في الجزء السفلي من غطاء طبق Petrie ثم يتم نقل كل بويضة مخففة في قطرة Hoechst واحدة ، مع الحرص على تقليل عرض الضوء أثناء عملية تلطيخ Hoechst ، عن طريق تغطية الطبق بغطاء داكن.

بعد عشر دقائق من التلوين ، لوحظت البويضات تحت المجهر الفلوري مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. بناء على تشكل الكروماتين ، يتم تصنيفها إما على أنها نواة محاطة ، SN ، إذا كانت تقدم حلقة من الكروماتين الإيجابي x حول النواة أو على أنها نواة غير محاطة ، NSN ، إذا كانت النواة تفتقر إلى حلقة من الكروماتين الموجب x وظهر الكروماتين الكلي مشتتا في النواة. يتم وضع أربع قطرات سعة ميكرولتر من وسط ألفا ميم على طبق بيتري ذو قاع زجاجي مع الحرص على إبقاء القطرات ضمن مسافة محددة ، ويتم تغطية القطرات بزيت معدني مسخن مسبقا وموازي ويتم نقل ما مجموعه ثلاث إلى أربع بويضات إلى كل قطرة.

يتم نقل طبق بيتري إلى غرفة الحضانة في مجهر بمرور الوقت ، مما يسمح بالحفاظ على الأسطوانة لدرجة الحرارة عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون والإضاءة بضوء LED الأحمر. قبل تحليل الفاصل الزمني ، باستخدام برنامج BioStation ، يتم تعيين إحداثيات كل قطرة من أجل أتمتة المرور من قطرة إلى أخرى أثناء روتين الفاصل الزمني. يتم التقاط إطارات اللقطات المتتابعة على فترات مدتها ثماني دقائق لمدة 15 ساعة.

ثم يتم تحليل الأفلام المسجلة باستخدام برنامج CellPave ، والذي يسمح باكتشاف الحركات السيتوبلازمية المعبر عنها من حيث متجهات السرعة. أولا ، باستخدام أداة CellPave ، يتم تحديد محيط كل بويضة يدويا. بعد ذلك ، يقوم البرنامج بحساب سرعة الحركة السيتوبلازمية التي تحدث في المقارنة بين إطارين متتاليين للفاصل الزمني ويعبر عنها عن طريق وضع سهم ملون تحدد شدة اللون والطول سرعة واتجاه الحركات.

يصف الرسم البياني الموجود أسفل البويضة الموضحة هنا السرعة الإجمالية للحركة السيتوبلازمية طوال فترة التسجيل البالغة 15 ساعة لبويضة SN. يتم إجراء نفس النوع من التحليل على بويضة NSN. لاحظ الجسم القطبي المتأخر ذروة بثق واحدة التي أظهرتها بويضة NSN مقارنة ببويضة SN.

يظهر الجزء السفلي من الشاشة النمط الزمني لسرعة حركة السيتوبلازمية للبويضة. يتم حساب السرعة من خلال مقارنة إطارين متتاليين. ثم يتم تصدير البيانات الأولية لسرعة الحركة السيتوبلازمية إلى ورقة Excel التي تتحدث عن التقارير ، على الصفوف ، وتسلسل Frens ، وعلى الأعمدة ، يتم تحليل البويضة الفردية.

على الجانب الأيسر ، بيانات بويضة SN ، بينما على الجانب الأيمن ، بيانات بويضات NSN. ثم يتم تقسيم بيانات بويضات SN أو NSN إلى 10 مجموعات فرعية. تسعة تستخدم للتدريب ، اللون الأخضر.

وواحد للاختبار الأعمى ، اللون الأحمر. يتم تكرار هذا الإجراء لمدة 10 مرات. في كل مرة تغيير عينة الاختبار الأعمى.

ثم يتم فحص البيانات من خلال شبكة عصبية اصطناعية للتغذية الأمامية ، أو FANN. تم تصميم FANN لتحليل إطارات الفاصل الزمني بالكامل ، والتي تسمى هنا الخلايا العصبية المدخلة"ترتبط الأخيرة بثلاث خلايا عصبية مخفية ، مرتبطة بنفسها بخليتين عصبيتين ناتجتين. يعطي أحد المخرجات احتمال أن يكون المدخلات عبارة عن بويضة مختصة.

والآخر ، على العكس من ذلك ، أن المدخلات عبارة عن بويضة غير كفؤة. تتوقع المقارنة بين المخرجين الكفاءة العقلية للبويضة بدقة 91.03 بالمائة. تم إعداد هذه التقنية لبويضات الفئران كما هو موضح هنا.

ومع ذلك ، فإن الاستدعاء المستقبلي هو اختباره على البويضات البشرية. في الواقع ، فإن الإجراءات غير الغازية من تحليل جودة البويضات مطلوبة بشكل خاص في مجال تقنيات التكاثر الاصطناعي.