تطوير التحليل في المختبر كوانتيتاتي الجذعية المكونة للدم والسلف الخلايا (هسبكس) في تطوير الأجنة الزرد

الهدف العام من هذا الاختبار هو تعداد وفحص تمايز الخلايا السلفية المكونة للدم في جنين الزرد النامي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة المهمة حقا في مجال المكونة للدم ، مثل عدد الخلايا الجذعية والسلفية الموجودة بالفعل في جنين الزرد النامي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وغير مكلفة نسبيا وسهلة التنفيذ.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لعدد الأسلاف الموجودة في أسماك الزرد النامية ، إلا أنها تسمح أيضا للباحثين بقياس التأثير الوظيفي للدواء أو الطفرة الجينية على تكوين سلف الدم. كانت لدينا فكرة عن هذه الطريقة ، عندما كنا نقضي على الجينات التي افترضنا أنها حاسمة لنمو الدم. توقعنا أننا سنكون قادرين على قياس الفرق بين الأجنة التي تتطور بشكل طبيعي وتلك التي كانت عبارة عن أشكال بهذا الفحص.

لتبييض أجنة أسماك الزرد ، استخدم حاويات بلاستيكية لإنشاء ثلاث محطات غسيل ، تحتوي واحدة على مليلتر واحد من خمسة بالمائة من مبيض لكل لتر واحد من E3 ومحطتان تحتويان على E3 المعقمة. باستخدام ماصة النقل ، ضع الأجنة في مصفاة الشاي واغمرها في محطة الغسيل رقم واحد لمدة خمس دقائق. ثم انقل مصفاة الشاي مع الأجنة إلى محطة الغسيل رقم اثنين لمدة خمس دقائق. كرر لمحطة الغسيل رقم ثلاثة لمدة خمس دقائق أخيرة.

بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة الأجنة من مصفاة الشاي عن طريق قلبها رأسا على عقب فوق طبق بتري نظيف يبلغ طوله 10 سم واستخدم ماصة نقل ومعقمة E3 لشطف الأجنة برفق من المصفاة. لإزالة الأجنة ، استخدم ماصة نقل لإزالة والتخلص من أكبر قدر ممكن من E3 من طبق بتري. ثم أضف 500 ميكرولتر من منتجات dechorionation إلى الأجنة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، اضغط برفق على جانب طبق بتري لإزالة المشيمات تماما. ثم ، باستخدام ماصة مصلية ، أضف 20 مل من E3 المعقم لتخفيف البرودياس. اسمح للأجنة بالاستقرار واستخدم ماصة لإزالة E3. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات لإزالة جميع آثار prodeas dechorionation.

لتحضير عينات الأجنة ، استخدم ماصة لوضع 10 أجنة في أنبوب واحد معقم من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بإخراج الماصة E3 بعناية وتخلص منها. انقل العينات إلى غطاء التدفق الصفحي ، واغسل الأجنة بإضافة مليلتر واحد من E3 المعقم ، مما يسمح للأجنة بالاستقرار في قاع الأنبوب.

بعد ذلك، استخدم ماصة P1000 لإزالة المادة الطافية. كرر لمدة ثلاث غسلات. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة E3 وتخلص منه.

ثم أضف مليلتر واحد من 10 ملليمولار DTT في E3 لإزالة الطلاء المخاطي وأي جراثيم أو خمائر أو بكتيريا قد تكون محاصرة فيه المحيطة بالأجنة. الآن ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق أفقيا واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة. لفصل الأجنة ، استخدم ملليلتر واحد من DPBS المعقم لغسل العينة ثلاث مرات.

بعد الغسيل الأخير ، أضف 500 ميكرولتر من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم وخمسة ميكرولترات من خمسة ملليغرام لكل مليلتر من منتجات التفكك. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية على شاكر مداري أفقي عند 180 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك ، ضع العينات وغطاء التدفق الصفحي واستخدم P1000 لترتيفات الأجنة حتى يتم فصل العينات تماما.

توخي الحذر وفحص الأجنة بشكل دوري لتحديد متى يتم فصلها. تريد أن تكون بعض الأنسجة موجودة. من الممكن الإفراط في هضم الأجنة التي ستدمر الخلايا السلفية.

ماصة الأجنة ال 10 المنفصلة على الخزان العلوي لأنبوب سفلي دائري بولي ستايرين سعة خمسة ملليلتر مع غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر. باستخدام ماصة وجهاز PBS معقم ، اشطف أنبوب الجنين وانقل المحلول إلى أنبوب بولي ستايرين سعة خمسة ملليلتر يحتوي على خلايا مفلترة. كرر الشطف حتى يوجد أربعة ملليلتر من السائل في الأنبوب.

بالطرد المركزي للأنابيب عند 300 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق للوحة عينة الخلية المتجانسة. باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها من الأنبوب السفلي المستدير ، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا المحببة في الأسفل. ثم استخدم 100 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق الخلايا.

قم بإعداد محلول مخزون ميثيل سلولوز كامل واحد واستخدم ثلاث محاقن مليلتر و 16 إبرة قياس لإضافة 2.5 مل من أنابيب 14 ملليلتر مستديرة معقمة. استخدم أنبوبا واحدا لكل حالة يتم اختبارها. للتمايز النخاعي ، أضف 1 بالمائة من مصل الكارب و 0.3 ملليغرام لكل مليلتر من عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية لسمك الزرد المؤتلف أو GCSF إلى وسط ميثيل السليلوز.

لتمايز الكريات الحمراء ، أضف 1 في المائة من مصل الكارب و 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من إريثروبويتين الزرد المؤتلف أو EPO إلى وسط ميثيل السليلوز. لفحص أسلاف متعددة الأنساب ، أضف EPO و GCSF. باستخدام ماصة ، أضف 100 ميكرولتر من الأجنة ال 10 المنفصلة إلى سطح ميثيل السليلوز المحضر مع السيتوكينات المؤتلفة في مصل الكارب.

قم بتغطية الغطاء ودوامة برفق لتجانس العينة بالكامل. يجب أن يحتوي كل أنبوب الآن على الأنسجة المنفصلة ل 10 أجنة. باستخدام ثلاث محاقن مليلتر و 16 إبرة قياس ، قم بتقسيم ملليلتر واحد من العينة إلى طبقين منفصلين من أطباق بتري مقاس 35 ملم.

تأكد من أن العينة مشتتة بالكامل في جميع أنحاء طبق بتري. كرر لكل عينة. ضع أطباق بتري مقاس 35 ملم مع الخلايا وميثيل السليلوز في طبق بتري 15 سم.

أضف إلى كل طبق كبير طبقا واحدا بحجم 35 ملم مع خمسة ملليلتر من الماء المعقم لترطيب العينات. احتضن الأطباق عند 32 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة سبعة إلى 10 أيام. أخيرا ، تخيل وحدات تشكيل المستعمرة وفقا لبروتوكول النص.

بعد سبعة أيام في الاستزراع بعوامل داعمة مكونة للدم ، تم إحصاء وتصوير أسلاف 48 من أسماك الزرد الجنينية HPF. الأهم من ذلك ، أن كمية التليف الكيسي المستخدمة ترتبط ارتباطا مباشرا بعدد الأجنة المطلية. طلاء إما أربعة أو ثمانية أجنة لكل مليلتر ، والذي يرتبط بالبدء ب 10 أو 20 أجنة ، في بداية التجربة ، ينتج ما يقرب من 1200 أو 2400 CFUs على التوالي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم الإفراط في هضم الأجنة لأن ذلك سيدمر الخلايا السلفية. باستخدام هذا الإجراء ، يمكنك مقارنة عدد الأسلاف الموجودين في نقاط زمنية مختلفة.

يمكنك مقارنة الطافرة بالحيوانات البرية ، وكذلك اختبار تأثير الأدوية على نمو الدم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار ميثيل السليلوز لتعداد أسلاف المكونة للدم. يمكنك تغيير هذا الإجراء ليناسب احتياجاتك التجريبية الخاصة، مثل اختبار سيتوكينات معينة.

لا تنس أن العمل مع دم الفقاريات والإبر يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما توخي الحذر عند إجراء هذا الفحص.