مرحلة الوقت الفاصل، خالية من التسمية، وكمية التصوير دراسة الخلايا السرطانية البشرية الساكنة والنشطة

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف الأنماط الظاهرية لخلايا الساركوما العظمية البشرية بطريقة منهجية تجمع بين تحليلات مورفولوجيا الخلايا والتكاثر والحركة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية فيما يتعلق بإنشاء السرطان البشري وتطوره. على وجه الخصوص ، الهروب من سكون الورم والتبديل الداخلي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحليل المعلمات متعددة الخلايا في وقت واحد من خلال هذه الطريقة المتكاملة عالية الانتشار. وهذا يشمل مساحة الخلية ، وسمك الخلية ، وحجم الخلية ، ومعدل التكاثر ، ووقت المضاعفة ، وسرعة الحركة ، والهجرة ، والحركة. للبدء ، قم بتسخين وسط الثقافة مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.

ثم قم بإزالة القوارير المبردة لخلايا الساركوما العظمية البشرية المنشأة للأوعية والأوعية الدموية من خزان النيتروجين السائل. اغمر الجزء السفلي من القوارير في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بهز القوارير المبردة برفق لتسريع عملية الذوبان. بمجرد إذابة الخلايا ، رش القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسح القارورة لتعقيمها.

ثم قم على الفور بشفط تعليق الخلية من القارورة وتعليقها برفق في 10 مل من وسط الثقافة الدافئ. بعد ذلك ، قم بعمل طرد مركزي لتعليق الخلية لمدة خمس دقائق لتكسير الخلايا. مرة أخرى في الغطاء ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 10 ملليلتر من وسط الثقافة الدافئ.

ثم انقل تعليق الخلية إلى قارورة T75. قم بسحب معلق الخلية برفق عدة مرات لتفريق الخلايا بالتساوي. ضع القارورة في حاضنة واترك الخلايا تلتصق لمدة 12 ساعة على الأقل.

قم بتغيير وسيط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة أيام. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80 إلى 100 في المائة ، قم بإزالة وسائط الثقافة من القارورة واغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من PBS المعقم بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول EDTA 0.25٪ في القارورة وقم بتدوير القارورة لفترة وجيزة.

احتضن القارورة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق ثم افحص الخلايا تحت المجهر للتأكد من تقريب الخلايا وفصلها. بمجرد فصل الخلايا ، استخدم ماصة لإضافة 10 ملليلتر وسط زراعة وقم بسحب الوسط برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت أي مجاميع خلوية متبقية. بعد عد الخلايا ، قم بزرع مليوني منها في قارورة T75 جديدة.

ضع القارورة في حاضنة وقم بتنمية الخلايا إلى ما بين 80 و 100 في المائة قبل زرع الخلايا لتجربة تصوير المرحلة الكمية. حصاد الخلايا عن طريق الهضم ثلاثي الأحواد وبذور خلايا الساركوما العظمية البشرية المكونة للأوعية والأوعية الدموية في ستة ألواح بئر بكثافة 50،000 إلى 300،000 خلية لكل بئر. قم بتغطية الخلايا بما مجموعه خمسة ملليلتر من وسط الاستزراع.

ثم احتضن الألواح لمدة 12 ساعة على الأقل لإتاحة الوقت للخلايا للالتصاق. استبدل الوسيط بوسائط جديدة قبل التصوير. قم بتنظيف زلة الغطاء عن طريق شطفها عدة مرات بالماء الجاري منزوع الأيونات.

ثم اغمره في محلول إيثانول بنسبة 75٪ لمدة 15 دقيقة. ضع زلة الغطاء المعقمة في شفاط التدفق الرقائقي حتى يجف. بعد ذلك ، ضع زلة الغطاء بعناية في صفيحة من ستة آبار ، وتجنب الفقاعات الواضحة.

ضع الطبق في الحاضنة للتوازن لمدة 15 دقيقة على الأقل. إذا تشكل ضباب على غطاء اللوحة ، فاستخدم قطعة قطن معقمة لمسحها قبل التصوير. افتح برنامج تصوير المرحلة الكمية وقم بتهيئة النظام.

تأكد من أن القيم مقبولة في المعايرة الذاتية لوقت التعريض الضوئي وتباين النمط وضوضاء الهولوغرام. بعد ذلك ، ضع لوحة الآبار الستة على مسرح مجهر صورة الطور الكمي. مرة أخرى في البرنامج ، انقر فوق الالتقاط المباشر.

ثم انتقل إلى قائمة تركيز البرنامج وحدد يدوي. بعد ذلك ، انتقل إلى قائمة إعداد المجهر وركز بشكل خشن على صور الطور للخلايا عن طريق ضبط مسافة العمل للحصول على الخطوط العريضة للخلايا في صور الطور. عند الانتهاء، ارجع إلى قائمة تركيز البرنامج وقم بتغيير إعداد التركيز البؤري إلى تلقائي.

انقر الآن على تجربة جديدة. ابدأ في تحديد مواضع الحصول على الصور باستخدام الماوس أو مفاتيح الأسهم الموجودة على لوحة الأرقام. انقر فوق تذكر بعد كل تحديد.

بمجرد تحديد جميع المواضع ، انتقل إلى قسم الفاصل الزمني وقم بإعداد فترات التصوير بحيث تكون أقصر من خمس دقائق والفترة الزمنية الإجمالية 48 ساعة. ابدأ التجربة بالنقر فوق التقاط. سيؤدي هذا تلقائيا إلى التركيز والحصول على الصور في المواضع المحددة في كل نقطة زمنية فاصلة.

بعد الحصول على الصورة ، قم بتحليل مورفولوجيا الخلايا بالنقر أولا على تحديد الخلايا. اضبط الإعداد الرقمي لعتبة الخلفية بحيث يتم فصل مناطق الخلايا جيدا عن ضوضاء الخلفية. بعد ذلك ، اضبط رقم الإعداد لحجم الكائن للتأكد من أن كل خلية تحتوي على نواة واحدة فقط.

قم بتعديل أي مقاطع خلوية لا تتطابق مع هذا المطلب يدويا باستخدام التغييرات اليدوية. ثم استخدم وظيفة تحليل البيانات في البرنامج لتحليل الخلايا. ابدأ تحليلا جديدا للبيانات بالنقر فوق تحليل جديد.

اسحب الصور المحددة إلى علامة تبويب الإطارات المصدر وسجل معلمات مورفولوجيا الخلية، بما في ذلك مساحة الخلية والسمك البصري والحجم لكل خلية على حدة. عند الانتهاء، اختر مخطط التبعثر أو وضع الرسم البياني وقم بتصدير البيانات كجداول أو أشكال. حدد ما لا يقل عن خمس صور متباعدة بفارق 12 ساعة وسجل أرقام الخلايا التي يوفرها البرنامج.

قم بتقدير معدل تكاثر الخلايا عن طريق التطبيع مع أرقام الخلايا الأولية ثم رسم أرقام الخلايا. أخيرا ، قم بتقدير وقت المضاعفة عن طريق تركيب نقاط البيانات باستخدام منحنى النمو الأسي. لتحليل حركة الخلية ، استخدم وظيفة خلايا التتبع في البرنامج.

ابدأ بالنقر فوق تحليل جديد لبدء تحليل بيانات جديد. ثم اسحب سلسلة من الصور من الفترة الزمنية ذات الاهتمام إلى علامة تبويب الإطارات المصدر. بعد ذلك ، ضمن وضع اختيار إضافة الخلايا ، اختر بشكل عشوائي من 10 إلى 30 خلية بالنقر عليها.

تأكد من مراجعة التتبع في سلسلة الصور. في حالة فقدان النظام لتتبع الخلية أو تتبع الخلية الخاطئة ، اضبط خلية التتبع يدويا بالنقر فوق تحديد لتحديد الخلايا أو بالانتقال إلى وضع التحديد والنقر فوق تعديل الموقع لتعديل موقع الخلية. عند الانتهاء ، انتقل إلى حركة المؤامرة واختر مخطط الصفوف لمسارات الخلية أو انتقل إلى مخطط الميزات ورسم المعلمات الأخرى المتعلقة بالحركة ، مثل سرعة الحركة والحركة والترحيل ومباشرة الهجرة.

تصدير البيانات كجداول أو أشكال. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم صور المرحلة الكمية على شكل صور ثلاثية الأبعاد. تصور الخلايا الموضحة هنا مورفولوجيا الخلية النموذجية لخلايا الساركوما العظمية البشرية المنشأة للأوعية والأوعية غير المنشأة.

يتم حساب سمك الخلية بواسطة معامل الانكسار وطول المسار البصري ويظهر هنا كمخطط مبعثر. أظهر نوعان مختلفان من فينو الخلايا تباينا توزيعا مختلفا ويشيران إلى أن الخلايا المنشأة للأوعية الدموية لها مساحات خلوية أصغر وسمك خلية أكبر من الخلايا غير المنشأة للأوعية. يمكن حساب معدل تكاثر الخلايا لنوعي الخلايا من الصور ثنائية الأبعاد مثل هذه ، والتي تم تقسيمها وتمتد على مدار يومين.

بالنسبة لهذه الأنواع المحددة من الخلايا ، لم يتم العثور على اختلافات ذات دلالة إحصائية. لتحديد خصائص حركة الخلية للخلايا ، يجب تحديد الخلايا الفردية وتتبعها بمرور الوقت. هنا يتم تحديد الخلايا المتعقبة بألوان مختلفة.

تم تتبع كل خلية على حدة على مدار أربع ساعات مع مسار مسارها الكلي الموصوف هنا حيث تكون نقطة الصفر هي موقع البداية ويشار إلى موقعها النهائي بالنقطة الملونة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تصوير الطور الكمي لمقارنة مجموعة من المعلمات المورفولوجية والسلوكية للخلية كميا. في هذه الحالة ، بين الأنماط الظاهرية للخلايا الوعائية وغير الوعائية.

بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث السرطان لاستكشاف الهروب من سكون الورم ودور وراثة الأوعية في هذه العملية. في منصة مستمرة وغير ملصقة. لا تنس أن العمل مع خطوط الخلايا البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.