تصنيع صفيف متعدد المكروية الخلوية اصطناعية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في سؤال رئيسي في مجال هندسة الخلايا الجذعية مثل كيف تغير البيئة الخلوية المكروية الأنماط الظاهرية الخلوية ووظيفتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر بيئة متعددة تم إنشاؤها بشكل مصطنع للخلايا في لوحة واحدة والتي لا يمكنك القيام بها بطريقة تقليدية في لوحة التلامس الدقيقة التي توضح أن هذا الإجراء سيكون فنيو كوكي يوشيموتو وريساكو ساكاي من مختبرنا. بعد إنشاء صور ثلاثية الأبعاد للأقنعة لمصفوفات ألياف النانو وقوالب من هياكل الموائع الدقيقة وفقا لبروتوكول النص.

استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد لطباعة الأقنعة والقالب. لتحضير محاليل البوليمر للغزل الكهربائي ، قم بتخفيف 13 في المائة من سائل PMGI باستخدام رباعي هيدروفوران إلى تسعة بالمائة. قم بإذابة 0.08 جرام من PS بنسبة حجم واحد إلى واحد من THF إلى ثنائي ميثيل فورماميد واستخدم وصيا سائلا لرفع الحجم إلى المليلتر النهائي الواحد من ثمانية بالمائة من الوزن لكل محلول PS للحجم.

قم بإذابة 0.1 جرام من GT في الماء والحمض الحمضي وخلات الإيثيل واستخدم محلول المذيبات المختلطة لرفع الحجم إلى المليلتر النهائي بوزن 10 بالمائة من محلول GT الحجمي. بعد ذلك ، باستخدام آلة الاخرق المغنطرون ، قم بإيداع طبقة بلاتينية بسمك خمسة نانومتر على لوحة قاعدة من البوليسترين والتي تعمل ككاثود في إعداد الغزل الكهربائي. قم بتحميل كل محلول بوليمر في حقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ قياس 23.

ثم قم بتثبيت المحاقن على مضخة حقنة على بعد 12 سم من مجمع جهاز الغزل الكهربائي. قم بتوصيل إبرة المحقنة بمصدر طاقة عالي الجهد واضبطها على 11 كيلو فولت. ثم اضبط معدل الضخ على 20 مل في الساعة وحافظ على درجة الحرارة والرطوبة عند 30 درجة مئوية وأقل من 30 بالمائة من حيث الحجم ، على التوالي.

الآن ضع القناع على لوحة القاعدة. ثم من خلال فتحات القناع ، قم بتصنيع ألياف النانو على لوحة القاعدة بكثافات مميزة عن طريق تغيير وقت الغزل الكهربائي. قم بإزالة القناع من لوحة القاعدة وكرر تصنيع ألياف النانو.

عند اكتمال المصفوفة ، ضعها في مجفف عند 25 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لتبخر المذيب المتبقي. لربط ألياف GT النانوية ، قم بمعالجتها ب 0.2 مولار EDC و 0.2 مولار NHS في الإيثانول. واحتضان العينات عند 25 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

لشطف ألياف النانو GT ، استخدم 99.5 في المائة من الإيثانول مرتين وجفف الألواح بالمكنسة الكهربائية عند 25 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. لتصنيع هياكل الموائع الدقيقة ، امزج 2 جرام من عامل معالجة PDMS و 20 جراما من قاعدة PDMS. ثم صب خليط ما قبل PDMS على القالب المصنع.

في المجفف ، قم بإزالة خليط PDMS لمدة 30 دقيقة. ثم قم بمعالجة خليط PDMS المسبق في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. لتجميع مصفوفات Macme ، انزع هيكل PDMS المعالج من القالب واستخدم 70 في المائة من الإيثانول لتنظيفه.

ثم تفريغ الهالة الجوية على الجانب السفلي من هيكل PDMS. قم بتجميع هيكل PDMS بسرعة باستخدام مجموعة ألياف النانو. ثم تخبز التجميع بالفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة يومين.

باستخدام DPBS ، اغسل H9HESCs المزروعة على طبق 35 ملم. ثم أضف 0.5 مل من البروتياز الخفيف التربسين المؤتلف إلى الطبق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. استنشق بعناية على خليط البروتياز الطافي.

أضف وسط HPSC على الفور وقم بتوزيع الوسط برفق على سطح الطبق بشكل متكرر لفصل الخلايا. ثم انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي الأنبوب 200 مرة الجاذبية لمدة ثلاث دقائق.

شفط المادة الطافية الخلايا في وسط HPSC الدافئ مسبقا. ثم ماصة 12 ميكرولترا من تعليق الخلية في كل غرفة ميكروسويديك. بعد وضع العلامات على الخلايا بالفلورسنت وفقا لبروتوكول النص ، انزع بنية الموائع الدقيقة PDMS من مصفوفة Macme.

ثم قم بإزالة PBMS المتبقي من مصفوفة Macme ، وأضف 90 بالمائة من الجلسرين في PBS إلى الخلايا الملطخة وقم بتطبيق زلة غطاء. أخيرا ، ضع اللوحة رأسا على عقب على مسرح المجهر الفلوري المقلوب. واستخدم برنامج التصوير المجهري للحصول على صور ملونة 12 بت.

تظهر هنا صور التألق المناعي ل H9HPSCs المزروعة بكثافة بذر أولية عالية على ألياف الجيلاتين النانوية وملطخة ب 3 علامات نمطية خلوية. تم استخدام تحليل SOM لتحويل مجموعات البيانات متعددة المعلمات عالية الأبعاد إلى خرائط ثنائية الأبعاد منخفضة الأبعاد لمقارنة التجانس وعدم تجانس مستويات التعبير لعلامات النمط الظاهري الأربعة في كل مجموعة بيانات وتم إجراء تجميع هرمي غير خاضع للإشراف لعقد SOM. كما هو موضح هنا ، أظهرت جميع المجموعات تعبيرا أعلى عن OCT4 مما لوحظ في مصفوفة هلام الغشاء القاعدي ، أو MG. أظهرت المجموعة الأولى إشارات EdU عالية ، مما يشير إلى أن معظم الخلايا كانت تتكاثر بنشاط.

وبالتالي ، كانت البيئات الدقيقة في المجموعة الأولى مناسبة لصيانة HPSC لأن HPSCs غير المتمايزة تتكاثر بسرعة عندما يتم تقصير مراحل فجوة دورة الخلية. تضمنت المجموعة الثانية الخلايا المزروعة بكثافة أولية غير كافية وخلايا نمت على سقالات 2D GT التي لا تدعم التجديد الذاتي ل HPSC. على سبيل المثال ، فقدت إشارة EdU لهذه العينة وزادت مستويات الملحق V بشكل طفيف مما يشير إلى أن الخلايا فقدت جذعيتها وأصبحت تدريجيا موت الخلايا المبرمج.

أظهر PMGI MidNF HighCD من المجموعة الثالثة التي تمثل البيئات الدقيقة التي تشتمل على مصفوفات ألياف النانو PMGI الاختلافات الأكبر في إشارات OCT4 و EdU مقارنة بالظروف الأخرى. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال الخلايا الجذعية لاستكشاف هندسة الأنسجة والفحص المتقدم.