استخدام أوتوميتالوجرافي لتعريب والتحديد الكمي لشبه الفضة في الأنسجة الحيتانيات

ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم السموم البيئية بشأن توزيعات الأعضاء الفرعية وتركيز المعادن الثقيلة داخل النظم البيولوجية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن AMG هي سهلة الاستخدام ومنهجية غير مكلفة، وهذا هو مساعد قيمة للتحقيق المعادن الثقيلة في الأنسجة. نستخدم الأنسجة من الدلافين والحيتان لإثبات البروتوكول.

ومع ذلك، نعتقد أن البروتوكول يمكن استخدامه في مجموعة متنوعة من أنواع الحيوانات. إظهار الإجراء مع ون تا لي سيكون شون وثينغ، وهو طبيب من معهدنا. تبدأ بجمع الزوجي مطابقة الكبد والأنسجة الكلوية لتحليل AMG من الحيتانيات التي تقطعت بها السبل, وتحديد الأنسجة في 10 مرات حجم 10٪ غير محايد buffered formalin لمدة 24 إلى 48 ساعة.

بعد ذلك، استخدم شفرات ميكروتوم الفولاذ المقاوم للصدأ القابل للتصرف لتقليم أنسجة الكبد والكلى الثابتة في كل منهما إلى سنتيمترين في مقطع سنتيمتر واحد، ثلاثة ملليمترات، ووضع أقسام الكبد والكلى من نفس الشخص في نفس الكاسيتات المسماة. يجفف الأقسام في معالج الأنسجة من خلال سلسلة من الغمرات المتدرجة من الإيثانول والزيلين، تليها غمرات البارافين لمدة ساعة وساعتين. بعد الغمر البارافين لمدة ساعتين، نقل الأنسجة إلى قيعان قوالب الأنسجة الفولاذية وتضمين عينات الأنسجة المجففة مع البارافين ذاب الطازجة.

هدئ من برودة كتل الأنسجة المضمنة في البرالين الثابتة والبارافين على لوحة باردة، حتى يتجمد البارافين، ويقطع كل كتلة في الدقيقة حتى يتعرض سطح الأنسجة. هدئ العينات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية ناقصًا لمدة 10 دقائق، والحصول على أقسام أنسجة خمسة ميكرومتر على الدقيقة. باستخدام ملاقط وفرش، ورفع شرائط من قسم الأنسجة كما يتم الحصول عليها، وتعويم لهم على سطح 45 درجة مئوية حمام الماء المقطر المزدوج، حتى يمكن فصلها، ووضعها على شرائح المجهر الفردية.

ثم ضع الشرائح على شريحة أكثر دفئا لمدة ساعة واحدة، في 60 درجة مئوية. ثم، ضع الشرائح في رفوف الشرائح، وفك البارافينيز المقاطع في ثلاثة أطباق تلطيخ مختلفة تحتوي على 200 إلى 250 ملليلتر من الزيليين النقي لمدة ثماني وخمس سنوات وثلاث دقائق. هيدرات عينات دي parrafinized في أطباق تلطيخ مختلفة من حلول الإيثانول متدرج، تليها الشطف في المياه المقطرة مزدوجة.

شطف أقسام مرة واحدة في برنامج تلفزيوني تكملها 5٪ تريتون X 100، عدة مرات في برنامج تلفزيوني وحدها، ومرّة واحدة في الماء الطازج المقطر المزدوج لمدة 30 ثانية لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، تسمية كل عينة مع 300 ميكرولترات من مزيج الفضة تعزيز مجموعة حل، لمدة لا تزيد عن 15 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح بالماء المقطر المزدوج، ومكافحة وصمة عار المقاطع في 300 ميكرولترات من الهماتروسيلين لكل شريحة، لمدة 10 ثوان.

اغسل الشرائح بماء الصنبور الجاري. جففها واركب الأجزاء مع متوسطة التركيب. ثم، التقاط 10 صور السوسنولوجية عشوائية من كل قسم الأنسجة، تحت الهدف 40X من المجهر الخفيف.

لتحليل الرسم التلقائي، أو AMG، الإيجابية للعينات، افتح الصور في برنامج تحليل الصور المناسب، وحدد الصورة، ونوع، وكومة RGB، لتقسيم الصورة الأولى إلى قنوات اللون الأحمر والأزرق والأخضر. في القناة الزرقاء، حدد الصورة، ضبط، والعتبة، لقياس النسبة المئوية للمنطقة مع إشارات AMG إيجابية في كل صورة، وتعديل يدويا قيمة قطع لعتبة كل صورة على أساس وجود مناطق إيجابية كاذبة في النوى، أو خلايا الدم الحمراء. انقر فوق تحليل، ثم قم بتعيين القياسات، ثم تحقق من كسر المنطقة، لتحديد تسجيل كسر المنطقة.

انقر فوق تحليل، وقياس، لعرض نسبة مئوية موجبة من كل صورة الهشتولوجية نسبة المساحة عمود من نافذة النتيجة. لتقييم العلاقة بين نتائج التحليل الطيفي كتلة البلازما مضمّن بشكل حثائي والقيم AMG-إيجابية، افتح برنامج الرسوم البيانية المناسبة. إنشاء ملف مشروع جديد، وحدد س ص والارتباط.

إدخال نتائج التحليل الطيفي كتلة البلازما إلى جانب الاستقراء وتحليلات AMG، واختيار التحليل، والارتباط، لتحليل قوة الارتباط بين نتائج التحليل من قبل تحليل ارتباط بيرسون. في المعلمات، إطار الانحدار غير الخطي، حدد نموذج انحدار مختلف في صفحة الاحتواء، وحدد طرق المقارنة في صفحة المقارنة. قم بتضمين المبلغ الإضافي لاختبار المربعات F، ومعيار معلومات Akaike.

وفقا لنتائج طرق المقارنة، حدد نموذج انحدار مناسب نسبيا في مقايسة الفضة النسيجية الحوتية، واستخدام مقايسة لتقدير تركيزات الفضة من الكبد الحوتي والأنسجة الكلى، مع تركيزات الفضة غير معروف. وتشمل الإشارات الإيجابية AMG-الحجم المتنوعة، البني إلى الحبيبات السوداء في السيتوبلازم من خلايا الكبد والخلايا كوبفر، وأحيانا غير متبلور، الأصفر الذهبي إلى البني AMG إيجابية في التجويف والغشاء الطابق السفلي من بعض الأنابيب الكلوية القريبة. هناك علاقة إيجابية بين نتائج التحليل الطيفي كتلة البلازما مقرونة الاستقرائي وقيم AMG الإيجابية في أنسجة الكبد والكلى المحللة، مع تراجع خطي مفضل من خلال الأصل، وفقا لمجموع إضافي من المربعات اختبار F، والمعيار المعلومات أكايكي.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن طريقة AMG هي طريقة مساعدة، ويجب استخدامها مع طريقة محددة أخرى، مثل ICPMS، لمراقبة التكوين الفعلي للمعادن الثقيلة في الأنسجة.