عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الكلى حول دور الاتجار ببروتين سطح الخلية في البروتينات وليس مرض الكلى البروتيني. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يسهل دراسة الاتجار البروتين السطحي الخلية في- vivo وأنه يمكن تحليل أكثر من بروتين واحد لكل تجربة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الاتجار سطح الخلايا الكبيّة، يمكن أيضا أن تطبق على نظم الأعضاء الأخرى التي يتم perfused ويمكن الوصول إليها عن طريق تقنيات العزل.

تبدأ من خلال تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع والتطهير الجانب البطني من الماوس تخدير مع 70٪ isopropyl. جعل قطع متوسط من خلال الجلد من الحوض إلى القص واستخدام ملاقط لإزالة الجلد من اللفافة البطنية. قطع الجلد على جانبي خط وسط البطن وجعل المتوسطة من خلال طبقة عضلات البطن من المثانة إلى xiphoid.

استخدام مقص ملقط لتقسيم العضلات إلى أربعة أرباع واستخدام اثنين من المشابك الجراحية لتأمين الربعين العلويين نحو عنق الحيوانات. وضع الحيوان تحت المجهر تشريح واستخدام مبادلة عقيمة لنقل جانبا الأجهزة الحشوية. باستخدام مقص غرامة، وقطع الرباط الكبدي.

باستخدام ملاقط الجراحية غرامة، ووضع خياطة واحدة حول الشريان المينارت الكبدي برانيال الشرايين الكلوية. وحول الشريان الأورطي، القريب من الشرايين الكلوية، في الغدة الكظرية. حرّر الشريان الأورطي من اللفة والدهون والأنسجة الأخرى.

ثم، المشبك في الوريد الكافا والشراية الأبهر في ذروة التشعب ووضع خياطة أخرى حول الشريان الأورطي من الشرايين الكلوية. استخدام ملاقط لتشد خياطة الأبهر القريبة، مما يخفف من تدفق الدم وقطع حفرة صغيرة نصف قطر الشريان الأورطي في الشريان الأورطي، وينعزل إلى الشرايين الكلوية. أدخل قسطرة 10 سنتيمترا تعلق على حقنة 10 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم في الشريان الأورطي.

وأصلح القسطرة بالأربطة المعدة ثم تبدأ في ضخ الكلى بمعدل تدفق مليلتر اثنين في الدقيقة. باستخدام مقص غرامة لقطع ثقب في الوريد الكلوي في الشرايين الكلوية وتضييق خياطة حول الشرايين الكبدية والميناتريانتي.

بعد أن تم تسليم كامل حجم برنامج تلفزيوني استبدال perfusate مع خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم تكملها 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر البيوتين لوضع العلامات السطحية. الاستمرار في ضخ الكلى بمعدل تدفق ميليليمترين في الدقيقة. عندما تم تسليم وحدة التخزين بأكملها، نعلق حقنة تحتوي على خمسة ملليلترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم تكملها 100 ملليمولار جليسين إلى القسطرة.

إخماد الكبيبات مع جميع المليلترات الخمسة من محلول الجليسين بمعدل تدفق مليلترين في الدقيقة. ثم اثقب الكلى بخمس ملليلترات من الثلج البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم المكملة مع 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل ملليلتر بمعدل تدفق ملليلتر في الدقيقة. وسوف الانصمام من الكبيبات مع الخرز المغناطيسي البني تكون مرئية على سطح الكلى.

عندما تم تسليم كل من الخرز إزالة كبسولة الكلى وحصاد الكلى في هيلوم. ضع الكلى في طبق ثقافة الخلايا 10 سم يحتوي على 15 ملليلتر من PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم. استخدام شفرة جديدة مزدوجة الحواف لقطع الكلى إلى أصغر القطع الممكنة.

نقل الأنسجة إلى أنبوب ملليلتر اثنين تحتوي على ملليلتر واحد من الكولاجيناز A لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، وخلط حل الأنسجة بلطف قبل وبعد الهضم مع تعديل 1000 ميكروليت ماص تلميح. في نهاية الحضانة ، قم بفرز الأنسجة المهضمة من خلال مصفاة خلايا 100 ميكرون. استخدام مكشطة الخلية والجليد البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم لهرس الأنسجة المتبقية من خلال مصفاة الخلية.

جلب الحجم النهائي من تعليق الخلايا الكلوية واحدة تصل إلى 50 ملليلتر مع الجليد الطازجة الباردة PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم وجمع خلايا الكلى عن طريق الطرد المركزي. إزالة supernatant ثم إعادة تعليق بيليه مع أقل قليلا من 1.5 ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم في حين دوامة ونقل تعليق الكبيات في أنبوب جديد ملليلتر. لغسل الكبيبات، ضع الأنبوب في مغناطيس لتجميع الكبيات.

بعد دقيقة واحدة، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لإزالة المابس. و أزيل الأنبوب من المغناطيس إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم إلى الأنسجة.

الميّزة الكبيميرولي أعلى ولون مرة واحدة ودوامة الخلايا. عودة أنبوب إلى المغناطيس وغسل كبيبرولي مرة أخرى كما أظهرت للتو. حتى وصلت نقاء عينة ما لا يقل عن 90٪ عن طريق ضوء تحليل المجهر في 40 إلى 100 X التكبير.

ثم جمع الخرز المغناطيسي تنقية glomeruli بواسطة الطرد المركزي. لتحقيق أكبر من نقاء 95٪، والكبيبيuli بحاجة إلى أن تغسل جيدا كما هو موضح. بيوتين perfusion يسهل وضع العلامات من الحلقات الشعرية في البيوتين ولكن لا تسيطر على الكلى الماوس perfused.

هطول الأمطار المناعية من جزء البيوتين من مقتطفات الكبيبية يكشف أن البروتينات عبر الmembrane الكبيبية nephrin وpodocalyxin هي مناعية مع البيوتين ولكن ليس مع جزء السيطرة. تلوين من الكسر المناعي مع streptavidin يؤكد كذلك وجود البيوتين يثن nephrin في الحيوانات التي تم غرسها في البيوتين ولكن لا السيطرة على الحيوانات التي غرست. إن بروتين البطانية الوعائية الوعائية كادهيرين التصاق داخل الخلايا وجزيء التصاق داخل الخلايا اثنين أيضاً مناعية داخل جزء البيوتين.

في المرحلة المبكرة من التهاب الكلية الكلى الكلي لوحظ انخفاض التعبير عن نيخر سطح الخلية في التهاب الكلية الكلوية مقارنة بالضوابط. في الواقع تحليل densitometic يظهر انخفاضا كبيرا من البيوتين اِثنت كلي في التهاب الكلية الكلى الكلى مقارنة مع وحدات التحكم. التحليل الكمي لمجموع نسبة الكلى إلى actin يكشف عن عدم وجود اختلافات كبيرة بين السيطرة وداء التهاب الكلية الكلى.

بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت كميات متساوية من podocytes في التهاب الكلية الكلوية والحيوانات التحكم. في أواخر التهاب الكلية الكلوية، تظهر الكلى السمية الكلية انتعاشاً في تعبير الكلى مع عدم وجود اختلافات كبيرة في كلية سطح الخلية مقاسة بين فئران الكلى التحكمية والسمية الكلوية الكلية والانخفاض الكلي الكلي في الكلى في الكلى. وعلاوة على ذلك، يتم تقليل أعداد podocyte بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر للحفاظ على حقن فقاعة خالية أثناء اتصالها من أجل تجنب انسداد الهواء من الكبيبات والعمل في ظل ظروف البرد الجليد مرة واحدة بدأت ضخ الكلى. بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عزل رنا كبيبات الكريات والبروتين للإجابة على أسئلة إضافية حول تعبير البروتين أو التفاعلات في الكلى الصحية والمُرَضَة.