الهندسة الوراثية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "الخلايا استناداً إلى" التحديد والنمو في البكتيريا
يناير 25, 2019
ديسكويديوم ديكتيوستيليوم كائن نموذج شعبية لدراسة العمليات الخلوية المعقدة مثل الهجرة الخلية والالتقام، والتنمية. الأداة المساعدة للكائن الحي يتوقف على إمكانية التلاعب بالجينات. نقدم هنا، أساليب ترانسفيكت الخلايا ديسكويديوم ديكتيوستيليوم أن التغلب على القيود القائمة لتثقيف الخلايا في سائل الإعلام.
قيمة هذا البروتوكول هو أنه يسمح تقريبا أي سلالة من discoideum dictyostelium أن يتم التلاعب بها من قبل علم الوراثة الجزيئية، بغض النظر عما إذا كانت تلك السلالة سوف تنمو axnically في المتوسطة السائلة أم لا. الميزة الأخرى لهذه التقنية هي أنها سريعة وبسيطة. نقل إلى الخلايا عبرfect مع البلازمي exochromosomal قبل البدء في مزج dictyosteliums.
يمكن التحقق من صحة النتائج بالفعل بعد يومين من نقل الرضاخ باستخدام المجهر. ومن غير المعتاد العمل مع خلايا dictyostelium وتعليق البكتيريا. سوف التصور تساعد على إعطاء المجربين فكرة كيف يتم تنفيذ الخطوات المختلفة للبروتوكولات.
إثبات الإجراء معي سيكون سودابة إيمانيكيا، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء، وإعداد 1000 ملليلتر من محلول عمل سورنسن العازلة مع كلوريد المغنيسيوم وكلوريد الكالسيوم وفقا لبروتوكول النص. بعد ذلك، استخدام مستعمرة واحدة من أيوجينات K لتطعيم لتر واحد من متوسطة LB.
السماح للبكتيريا أن تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز. تدور الخلايا في اثنين من أنابيب الطرد المركزي 500 ملليلتر لحصاد الخلايا. ثم، وغسل البكتيريا مرة واحدة مع 500 ملليلتر من العازلة.
إعادة بناء بيليه في 20 ملليلتر من العازلة. استخدم مقياس ضوئي للتحقق من الكثافة البصرية للعينة وتمييع العينة مع المخزن المؤقت حتى تبلغ الكثافة البصرية حوالي 100. بعد ذلك، قم بإعداد المخزن المؤقت للكهربة H40 وفقًا لبروتوكول النص.
تنمو ك aerogenes لالتقاء متوسطة SM بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. إضافة 400 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى لوحة أجار SM ونشرها بالتساوي. ثم، واتخاذ حلقة عقيمة وتطعيم مع خلايا dictyostelium ونشر الخلايا على حافة واحدة من لوحة.
احتضان لوحة في 22 درجة مئوية لمدة يومين، لضمان مناطق النمو كبيرة بما يكفي لtransfete. أضف 10 ملليلترات من تعليق الأيروجين K إلى طبق بيتري معالج بثقافة الأنسجة طوله 10 سنتيمترات. ثم، استخدم حلقة تطعيم 10 ميكرولتر يمكن التخلص منها لكشط الخلايا من مناطق النمو في لوحة الثقافة.
نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر، التي تحتوي على الجليد الباردة H40 العازلة. تدور الخلايا لمدة ثانيتين في 10000 مرة الجاذبية. ثم، تجاهل عظمى وإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت H40.
بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من الخلايا إلى أنبوب يحتوي على ميكروغرام واحد إلى اثنين من الحمض النووي. الماصات صعودا وهبوطا لخلط ونقل خليط الحمض النووي الخلية إلى cuvette الكهربائي قبل المبردة. لا تضيف أكثر من اثنين من ميكروغرام من الحمض النووي.
أعلى تركيز الحمض النووي هي سامة للخلايا والحد من الكفاءة. بعد الكهربة، نقل الخلايا على الفور إلى طبق بيتري معد 10 سنتيمترا والسماح للخلايا للتعافي لمدة خمس ساعات. لتحديد transfectant لضربة قاضية ، بالضربة القاضية ، أو فعل خمسة في الضربة القاضية ، وفصل الخلايا من طبق بيتري عن طريق الأنابيب السائل على السطح.
ثم، اقامة ثلاثة تخفيفات من عامل انتقائي وفقا لبروتوكول النص. وأخيرا، توزيع 150 ميكرولترات من التخفيفات المعدة في كل بئر من 96-جيدا مسطح القاع لوحات ثقافة الأنسجة. في هذا البروتوكول، تم عرض نظام بلازمي خارج هتكروموسوم مراسل مزدوج.
بعد 32 ساعة من عملية التهيّن، عبّرت غالبية الخلايا عن كلا بروتينات الانصهار ذات التسمية الفلورية. كما حاول قانون خمسة M الكرز طرق الدخول وNNC4. تم الحصول على اثنين من العصابات بعد تشغيل هضم على هلام agarose.
يحتوي شريط زوج 4127 الأساسي على البناء المطلوب. تم استخدام الحمض النووي المنقى لتحول خلايا NC4. تم تحليل اثنين من استنساخ من نقل NC4 عن طريق PCR وكلاهما أظهر أنماط الفرقة المتوقعة.
ثم استخدمت البقعة الجنوبية للتحقق من صحة نتائج PCR. نمت NC4 بشكل أسرع على المروج البكتيرية من خلايا Ax2. بعد أربع ساعات، تمكن المزيد من خلايا NC4 من الزحف تحت أغاروز من خلايا Ax2.
كانت خلايا NC4 أسرع وأظهرت استجابة كيمائية أقوى للفولات من خلايا Ax2. دائما استخدام الخلايا من إعداد حديثا حتى لوحات SM. أبدا استخدام الخلايا أقدم من أربعة أيام، وإلا سوف تنخفض الكفاءة.
سلالات هايب البيضاء المعزولة حديثاً، غير إضاءات يشيع استخدامها لمعالجة الأسئلة المتعلقة بالسلوك الاجتماعي أو السلوك الاجتماعي للديكتيوستيليوم. يسمح لدينا لتطبيق علم الوراثة الجزيئية من خلال تلك العزلات.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لترانسفكشن خلايا Dictyostelium discoideum، مما يسمح بإجراء التلاعب الجيني بغض النظر عن ظروف نمو السلالة. وتتميز هذه الطريقة بأنها فعالة وبسيطة، مما يتيح التحقق السريع من النتائج.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- التلاعب الجيني
- الكائنات النموذجية
خلفية علمية
- Dictyostelium discoideum هو كائن نموذجي يُستخدم على نطاق واسع لدراسة العمليات الخلوية.
- تعد التعديلات الجينية أمراً بالغ الأهمية لاستكشاف مختلف التساؤلات البيولوجية.
- تعاني الطرق الحالية من قيود تعتمد على ظروف نمو السلالات المختلفة.
- يهدف هذا البروتوكول إلى التغلب على هذه القيود.
الغرض من الدراسة
- توفير طريقة موثوقة لنقل الجينات إلى سلالات مختلفة من Dictyostelium discoideum.
- تسهيل تطبيقات الوراثة الجزيئية في السلالات التي لا تنمو بشكل أحادي التغذية.
- إثبات كفاءة عملية نقل الجينات.
الطرق المستخدمة
- تحضير المحاليل البكتيرية والمحاليل المنظمة لعملية transfection.
- إجراء electroporation لخلايا Dictyostelium discoideum باستخدام plasmid DNA.
- التحقق من نتائج transfection باستخدام المجهر وPCR.
- تقييم سلوك الخلايا ونموها استجابةً لعملية transfection.
النتائج الرئيسية
- نجاح عملية عفن (transfection) لسلالات متعددة من Dictyostelium discoideum.
- ملاحظة تعبير البروتينات الفلورية بعد 32 ساعة من عملية العفن.
- أظهرت خلايا NC4 نمواً واستجابة كيميائية (chemotactic response) أسرع مقارنة بخلايا Ax2.
- التحقق من التعديلات الجينية من خلال تحليل PCR وبصمة Southern (Southern blot).
الاستنتاجات
- يتيح هذا البروتوكول إجراء تلاعب جيني فعال لسلالات Dictyostelium discoideum.
- يوفر هذا البروتوكول إطاراً للدراسات المستقبلية حول السلوك الخلوي وعلم الوراثة.
- تحقق السلالات المعزولة حديثاً أفضل النتائج فيما يتعلق بكفاءة عفن التحول (transfection efficiency).
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول التلاعب الجيني بسلالات Dictyostelium البرية التي تنمو على البكتيريا، متجاوزاً بذلك القيود التي تفرضها السلالات المتكيفة مع البيئة العقيم (axenic-adapted) والتي تعاني من اضطراب في إشارات Ras. كما يوفر طريقة سريعة وقابلة للتوسع للتحقق من الأهداف في نظام نموذجي ذي صلة بالمرض، مما يدعم تقليل المخاطر الآلية في مرحلة الاكتشاف المبكر. ويمدد هذا النهج تطبيقات الوراثة الجزيئية لتشمل السلالات المعزولة بيئياً، مما يعزز الاستمرارية الترجمية والثقة التنبؤية في سير عمل الفحص المظهري.
التطبيقات الاستراتيجية في أبحاث وتطوير الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية في مسارات الإشارات والحركية غير التالفة من خلال استخدام سلالات غير معقمة (non-axenic) ذات إشارات Ras سليمة.
- القيمة التشغيلية: تقلل من التداخلات التجريبية الناتجة عن عيوب عملية الالتقام الكبير (macropinocytosis) وضعف الهجرة الملاحظ في السلالات المعقمة (axenic).
- القيمة التنبؤية: تدعم التحقق من الأهداف الوظيفية والحد من المخاطر البيولوجية من خلال السماح بإجراء الطفرات في ظروف نمو ذات صلة فسيولوجياً.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج خلايا مأشوبة تعبر عن مراسلين فلوريين مزدوجين خلال 32 ساعة، مما يتيح قراءات سريعة للمقايسة من أجل فحص المركبات.
- القيمة التشغيلية: توحيد سير عمل عفن التحول باستخدام المستعمرات البكتيرية والتثقيب الكهربائي، مما يحسن قابلية التكرار بين المختبرات.
- قابليـة التوسع: تسريع الجدول الزمني من عملية التحول إلى الحصول على مستنسخات تم التحقق من صحتها في غضون أيام بدلاً من أسابيع، مما يدعم هندسة السلالات عالية الإنتاجية.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يسهل دراسة الانجذاب الكيميائي والسلوك الاجتماعي في السلالات البرية المعزولة حديثاً، مما يعزز من صلة نماذج الأمراض بالواقع.
- القيمة التشغيلية: يتيح التطبيق المباشر للوراثات الجزيئية على العزلات البيئية دون الحاجة إلى تكيف مسبق في ظروف معقمة.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط التحقق من الأهداف في مرحلة الاكتشاف بالأنماط الظاهرية قبل السريرية من خلال مخرجات قابلة للقياس مثل الانجذاب الكيميائي المحفز بالفولات واختبارات اختراق الآغاروز.
تكامل مسار العمل والتدفق التشغيلي
تندرج هذه الطريقة ضمن المراحل الممتدة من الاكتشاف المبكر وحتى تحديد المركبات الرائدة، وذلك من خلال توفير نماذج قابلة للتعديل وراثياً لاستنطاق المسارات الحيوية والفحص المظهري.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات في عمليات الانتحاء الكيميائي، والاحتساء الكبير، وإشارات النمو باستخدام سلالات برية سليمة.
- الفحص: توفر قراءات كمية للفلورة والنمو على المستعمرات البكتيرية لتقييم المركبات بشكل موثوق.
- التحليلات: تتيح التحقق من التعديلات الجينية عبر PCR وSouthern blot والمجهر خلال 32–48 ساعة بعد عملية عفن التحول (transfection).
- الأبحاث الانتقالية: تربط التلاعب الجيني بالمقاييس الوظيفية مثل الانتحاء الكيميائي والنمو تحت الأجاروز، مما يوجه التقدم المدروس وفقاً للمخاطر.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لهندسة أي سلالة من Dictyostelium، بغض النظر عن مصدر العزل أو ظروف النمو.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية عن طريق إزالة الشوائب الناتجة عن التكيف العقيم واستعادة مسارات الإشارات الأصلية.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار من خلال توحيد تحضيرات المحاليل المنظمة، ومعايير التثقيب الكهربائي، وبروتوكولات الاختيار.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال عن طريق تقليل الجداول الزمنية لهندسة السلالات وتمكين اتخاذ قرارات سريعة بالمضي قدماً أو التوقف في عملية التحقق من الأهداف.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال إنشاء نماذج خالية من المخاطر ميكانيكياً مع تعديلات جينية تم التحقق منها.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم الأحياء الدقيقة لتحضير المزارع البكتيرية والتعامل مع Dictyostelium على المسطحات البكتيرية.
- يعتمد على توفر أجهزة التثقيب الكهربائي وبنية تحتية معقمة لزراعة الأنسجة لخطوات عفن التحول والتعافي.
- يستلزم توحيد كثافة اللقاح البكتيري (OD ~100) وتحضير محلول H40 المنظم بين جميع المستخدمين.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند تطبيق البروتوكول على عزلات مختلفة من النوع البري أو السلالات البيئية.
- يقتصر على السلالات القادرة على النمو على المسطحات البكتيرية؛ حيث تنخفض الكفاءة مع الخلايا التي يتجاوز عمرها أربعة أيام بعد العزل.
