NMR القائمة على تحليل النشاط لتحديد تثبيط مركب, قيم IC_50, نشاط Artifactual, ونشاط الخلية الكاملة من النوكليوسيد الريبوهيدرولاسيس

توفر مقايسات النشاط المستندة إلى NMR طريقة فعالة لتحديد وتقييم والتحقق من صحة مثبطات الإنزيم. وهي مناسبة بشكل خاص لفحص الشظايا. إن مقايسات NMR قابلة للتركيزات المركبة الأعلى المطلوبة لمثبطات الأضعف.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود إنزيمات المراسل يجعلها أقل عرضة للايجابيات الكاذبة. نستخدم مقايسات NMR في مختبرنا لتحديد وتوصيف مثبطات اثنين من الإنزيمات من المهبل Trichomonas. كلا الإنزيمات تمثل أهدافا جديدة للأدوية المضادة للtrichomonal رواية.

وMR المقاييس عموما تنطبق على أي مجال من مجالات البحوث التي تنطوي على الإنزيمات, ويمكن حتى أن تستخدم لدراسة الإنزيمات داخل الخلايا. أهم جوانب هذه التقنية هي التأكد من أن وحدات التخزين الكاشفة الصحيحة يتم مزجها بشكل دقيق ومكونات التفاعل. لإعداد الركيزة واختبار المركبات، إضافة 12 ميكرولترات من الركيزة إلى كل من أربعة أنابيب ميكروفروج 1.5 ملليلتر وإضافة ستة ميكرولترات من DMSO deuterated إلى التحكم لمدة صفر دقيقة وأنابيب التحكم لمدة 30 دقيقة.

إضافة ستة ميكرولترات من مجمع الاختبار إلى أنبوب تجريبي الأول وثلاثة ميكرولترات من مجمع الاختبار وثلاثة ميكرولترات من DMSO deuterated إلى أنبوب تجريبي الثاني. بعد ذلك، أضف 300 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على 2.59 ملليلتر من عازلة التفاعل، تليها 25 ميكرولترات من محلول الإنزيم. عكس بلطف أنبوب مرتين لمزيج رد فعل الأسهم حل وإضافة 10 ميكرولترات من 1.5 حمض الهيدروكلوريك المولر إلى أنبوب 1.5 ملليلتر تحتوي على 582 ميكرولترات من محلول الأسهم رد فعل.

ثم، نقل كامل حجم رد فعل حل الأسهم وحمض إلى أنبوب التحكم في الدقيقة الصفر لبدء في وقت واحد وإرواء رد فعل التحكم في الدقيقة الصفر. التعرق والاستغناء عن العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكن متعمدة. بدء وتشغيل ردود الفعل الثلاثة المتبقية بطريقة متداخلة، على الفور نقل 582 ميكرولترات من حل الأسهم رد فعل إلى أنبوب التجريبية الأولى وخلط العينة مرتين كما هو موضح للتو.

ويضمن الطموح الدقيق والاستغناء خلط كامل خلال خطوات البدء. كن متناسقاً مع كل عينة لضمان أن الخلط التفاضلي ليس متغيرًا. بعد 30 ثانية، نقل 582 ميكرولترات من محلول الأسهم رد فعل إلى أنبوب التجريبية الثانية ومزيج، تليها إضافة 582 ميكرولترات أخرى من حل الأسهم رد فعل إلى أنبوب التحكم لمدة 30 دقيقة 30 ثانية بعد بدء التفاعل في أنبوب تجريبي الثاني.

بعد 30 دقيقة، إضافة 10 ميكرولترات من حمض الهيدروكلوريك 1.5 مولر إلى الأنبوب التجريبي الأول، وتكرار التبريد على فترات 30 ثانية لأنابيب التحكم التجريبية الثانية و 30 دقيقة. عندما تم إخماد جميع ردود الفعل، نقل 600 ميكرولترات من الحل من كل رد فعل لأنابيب NMR. لحساب نسبة التحويل للركيزة لأطياف التحكم، قم بتحميل العينات على المطياف، وجمع أطياف NMR، وتراكب الأطياف لعناصر التحكم صفر و30 دقيقة.

تحجيم إشارة الركيزة في عنصر التحكم في الدقيقة صفر لتطابق عنصر التحكم 30 دقيقة ولاحظ هذه النسبة المئوية. ثم، حساب التحويل النسبة المئوية كـ 100 ناقص النسبة المئوية من مطابقة إشارات الركيزة. لحساب نسبة التحويل في المئة من الركيزة لردود الفعل التي تحتوي على مجمع الاختبار، تراكب أطياف لمراقبة دقيقة الصفر وأول رد فعل يحتوي على مركب اختبار 500 ميكرومولار ومقياس إشارة الركيزة في عنصر التحكم في الدقيقة الصفر لتتناسب مع الطيف مع مجمع الاختبار.

لاحظ هذه النسبة المئوية، واستخدمها لحساب نسبة التحويل كما هو موضح فقط. ثم تراكب الأطياف للتحكم في الدقيقة الصفرية والتفاعل الأول الذي يحتوي على مركب اختبار 250 ميكرومولار، وقم بتحجيم إشارة الركيزة في عنصر التحكم في الدقيقة الصفر لمطابقة الطيف مع مركب الاختبار. بعد الإشارة إلى النسبة المئوية، استخدمها لحساب النسبة المئوية للتحويل.

لحساب نسبة التفاعل ونسبة التثبيط لكل تركيز مركب اختبار، أولاً، حساب نسبة التفاعل كتحويل النسبة المئوية لمركب الاختبار، مقسوماً على النسبة المئوية للتحويل من مرات التحكم 100. ثم حساب في المئة تثبيط 100 ناقص رد فعل في المئة. لإجراء فحص شاشة مضادة للمنظفات ، أضف 300 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم و 25 ميكرولترات من محلول الإنزيم إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على 2.59 ملليلتر من عازلة التفاعل.

عكس بلطف أنبوب مرتين لخلط حل الأسهم رد الفعل، وإضافة اثنين من ميكرولترات من المنظفات تريتون X-100 إلى 20 ملليلتر من العازلة رد فعل. ثم، إضافة 2.59 ملليلتر من العازلة رد فعل، التي تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100 المنظفات إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر جديدة. ثم إضافة 300 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم و 25 ميكرولترات من محلول انزيم إلى الأنبوب.

عكس بلطف أنبوب مرتين لمزيج رد فعل الأسهم الحل. ثم، تحديد تثبيط في المئة لمركبات اختبار 100 ميكرومولار و 50 ميكرومولار كما هو موضح للتو. باستخدام محلول الأسهم رد فعل دون المنظفات، لمجموعة واحدة من أربعة أنابيب ومحلول الأسهم رد فعل مع المنظفات لمجموعة ثانية من أربعة أنابيب.

لإجراء تخفيف القفز، ونقل 468 ميكرولترات من العازلة رد فعل و 60 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم إلى أنبوب يحتوي على 53.8 ميكرولترات من العازلة رد فعل، وخمسة ميكرولترات من محلول انزيم، و 1.2 ميكرولترات من DMSO التي تم احتضان لمدة 30 دقيقة. التعرق والاستغناء عن الخليط مرتين بطريقة بطيئة، ولكن متعمدة. قبل نقل 468 ميكرولتردات من العازلة رد فعل و 60 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم إلى أنبوب يحتوي على 53.8 ميكرولترات من العازلة رد فعل، وخمسة ميكرولترات من محلول انزيم، و 1.2 ميكرولترات من مجمع الاختبار الذي تم احتضان لمدة 30 دقيقة.

اخلطي رد الفعل الثاني مرتين كما هو موضح. ونقل فورا 588 ميكرولتررس من الحل من أنبوب التحكم DMSO القفز- التخفيف إلى أنبوب يحتوي على 12 ميكرولترات من الركيزة مع الاختلاط. مواصلة نقل 588 ميكرولترتر من أنبوب مجمع اختبار القفز- التخفيف, أنبوب التحكم DMSO غير مخفف, واختبار غير مخفف أنبوب مركب إلى كل من ثلاثة 1.5 ملليلتر أنابيب, تحتوي على 12 ميكرولترات من الركيزة لكل أنبوب مع خلط على فترات 30 ثانية بعد ذلك.

ثم انتظر 30 دقيقة قبل إخماد ردود الفعل، وجمع أطياف NMR، وحساب تثبيط في المئة لكل مركب كما أظهرت للتو. هنا تظهر نتائج اختبار مركبين ضد AgNH في اختبار مركب اختبار أولي باستخدام البروتون NMR كما هو مبين. ومن السهل ملاحظة رد فعل الإنزيم وتحديده كمياً باختفاء الرنين الأدينوسين المفرد والمزدوجة عند 8.48 و6.09 جزء لكل مليون على التوالي.

وظهور مسكن أحادي الأدينين عند 8.33 جزء في المليون كما لوحظ في طيف التحكم لمدة 30 دقيقة. في هذا الشكل، تظهر نتائج اختبار مركب في تركيزين ضد AgNH في مقايسة مضادة للفحص المنظفات باستخدام البروتون NMR كما هو مبين. ويلاحظ فقط أدنى الاختلافات في كثافة الركيزة وإشارات المنتج باستخدام الشرطين، مما يشير إلى أن تثبيط الإنزيم الملاحظ ليس من الآثار المركبة التجميعية.

لاحظ أن الرنين الناشئ عن المركب المختبر والمنظفات لا تتداخل مع الركازة أو صدى المنتج. نتائج اختبار مركب في اختبار القفز المخفف ضد AGNH باستخدام البروتون NMR كما هو موضح تكشف عن انخفاض كثافة إشارة الركيزة في تفاعل 20 ميكرومولار مقارنة برد فعل 200 ميكرومولار، مما يشير إلى أن تثبيط هو عكسها. عينة كاملة خلط أثناء بدء كل رد فعل وللورق القفزية أمر بالغ الأهمية.

والمطلوب هو التطلع والاستغناء الدقيقين والثابتين. ويمكن أيضا أن تستخدم المقايسات المستندة إلى NMR لقياس نشاط الانزيم في الخلايا الكاملة، وذلك باستخدام محلول يحتوي على الخلايا المعلقة بدلا من العازلة رد الفعل والانزيم. جهودنا المضادة للثميرونية اكتشاف المخدرات لا تزال تعتمد على هذه المقايسات لقياس قوة المركبات المركبة حديثا توليفها ضد الانزيمات ريبوهيدرولاس.

على الرغم من أنه يستخدم بكميات صغيرة جداً فقط، فإن حمض الهيدروكلوريك المستخدم لإخماد ردود الفعل خطير وينبغي استخدامه مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.