مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

يعد اختبار قارئ الصفائح القوي مثل اختبارنا مفيدا جدا للفحص الأولي لمثبطات ميثيل ترانسفيراز المحتملة. تعد القدرة على جمع البيانات في الوقت الفعلي ميزة كبيرة للفحص المستمر المقترن بالنوكلياز الداخلي. ابدأ بإعداد 600 ميكرولتر من ظروف الفحص التي تحتوي على 20 ميكرومولار و 50 ميكرومولار بشكل منفصل في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على الجليد.

للقيام بذلك ، أضف الماء المقطر المزدوج ومخزن المثيلة 5X إلى كل أنبوب لتحقيق تركيز نهائي من 1X العازلة مثيلة. بعد ذلك ، أضف 3.15 ميكرولتر من 20 ملليغرام لكل ملليلتر من زلال مصل الأبقار ، أو BSA ، إلى كل عينة. بعد ذلك، أضف اثنين ميكرولتر من ركيزة الحمض النووي (DNA) البالغة 3.15 ميكرومولار و1.33 ميكرولتر من 4.75 ميكرومولار S-adenosylmethionine أو SAM إلى كل عينة.

أضف المانع إلى العينات المناسبة لتحقيق تركيز نهائي قدره 21 ميكرومولار أو 52.5 ميكرومولار وكمية مكافئة من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، أو DMSO ، إلى عينة تحكم قبل خلط المحاليل عن طريق الدوامة بمعدل 3000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث ثوان. بعد ذلك ، قم بتدوير العينات لبضع ثوان في جهاز طرد مركزي صغير على طاولة الطاولة بمعدل 1 ، 200 مرة G لضمان جمع المحلول في قاع الأنبوب. حاصل 95 ميكرولتر من كل محلول فحص في ستة آبار متتالية في نصف منطقة سوداء 96 لوحة بئر.

قم بإعداد 75 ميكرولتر من محلول إنزيم Gla I أو DNMT1 plus Gla I في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة كما هو موضح من قبل إلى تركيز نهائي من المخزن المؤقت لمرة واحدة. بعد ذلك ، أضف 1.2 ميكرولتر من 10 وحدات لكل ميكرولتر Gla I إلى كل محلول لتحقيق تركيز نهائي قدره 0.16 وحدة لكل ميكرولتر. أضف 0.6 ميكرولتر من خمسة ميكرومولار تفتقر إلى RFTS DNMT1 إلى محلول DNMT1 plus Gla I للحصول على تركيز نهائي قدره 40 نانومولار.

بعد الخلط اللطيف ، قم بتدوير العينات لبضع ثوان في جهاز طرد مركزي صغير منضدية عند 1،200 G لضمان جمع المحلول في قاع الأنبوب. بعد ذلك ، قم بتقسيم 12 ميكرولترا من كل محلول إنزيم في ستة آبار في صفيحة بئر مخروطية القاع 96. لفحص المثيلة لعينة الحمض النووي ، سخن قارئ اللوحة مسبقا إلى 37 درجة مئوية.

ثم أدخل اللوحة السوداء التي تحتوي على حلول الفحص في قارئ اللوحة. بعد هز اللوحة عند 425 دورة في الدقيقة ، قم بقياس التألق بطول موجة إثارة يبلغ 485 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 528 نانومتر. ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة لوحة الفحص من قارئ اللوحة وأضف خمسة ميكرولترات من محلول الإنزيم إلى كل بئر ، متبوعا بخلط المحلول عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. أدخل اللوحة في قارئ اللوحة وهز اللوحة قبل تسجيل التألق كل 53 ثانية لمدة 30 دقيقة. احصل على متوسط التألق لمقايسات التحكم Gla I الثلاثية لكل حالة واطرح متوسط Gla I الذي يحتوي على صواني تفاعل التحكم من الآثار الثلاثية التي تم الحصول عليها في وجود DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS.

بعد ذلك ، حدد متوسط الخطأ المعياري للمتوسط للنسخ المتماثلة المصححة. ارسم متوسط تتبع التفاعل المصحح وقم بتركيب الجزء الخطي الأولي مع خط لتحديد السرعة الابتدائية. أوجد النسبة المئوية للنشاط بقسمة السرعة المرصودة في وجود مركب على السرعة المرصودة في DMSO التي تحتوي على تفاعل التحكم وضربها في 100.

أظهرت نتائج الفحص المقترن بنوكلياز داخلي متقطع أن الحمض النووي للمنتج الميثيلي بالكامل محمي من الانقسام ، مما يؤكد أن DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS نشط وقادر على ميثيل الحمض النووي للركيزة نصف الميثيل. في الفحص القائم على التألق ، في غياب Gla I ، لم تؤثر إضافة DNMT1 أو المخزن المؤقت وحده على مضان الخلفية. أدت الإضافة اللاحقة ل Gla I إلى جميع المقايسات إلى توليد مضان فقط في المقايسات التي تحتوي على DNMT1.

أدت الإضافة المتزامنة ل DNMT1 و Gla I التي تفتقر إلى RFTS إلى ثلاثة مقايسات إلى توليد مضان قوي. لم تنتج إضافة Gla I وحدها أي مضان. للكشف عن مثبطات محتملة ، تم فحص نشاط مثيلة الحمض النووي ل DNMT1 الذي يفتقر إلى RFTS في وجود DMSO أو المركب الأول أو المركب الثاني أو المركب الثالث بتركيزات 20 و 50 ميكرومولار.

يجب التحقق من صحة المركبات التي تقلل من توليد التألق في هذا الفحص المزدوج. يعد التأكد من أن المركبات لا تثبط إنزيم الاقتران خطوة تالية مهمة.