إعداد Tunable خارج الخلية مصفوفة microenvironments لتقييم شوان الخلية الظاهري مواصفات

يوفر هذا البروتوكول منصة ثقافة الخلية حيث يمكن التحكم بدقة خصائص المصفوفة خارج الخلية مثل صلابة وتكوين البروتين ومورفولوجيا الخلية بطريقة فعالة من حيث التكلفة والهوى. وهذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة ولا تتطلب تدريبا خاصا أو مرافق خاصة. كما أنها متوافقة مع طرق متعددة الكم الخلوي مثل تلطيخ مناعي ولطخة غربية.

هذه التقنية توفر فهم ميكانيكي لبيولوجيا الخلية شوان. مع نظرة إضافية في تصميم المواد الحيوية لتجديد الجهاز العصبي، ويمكن تطبيقه على أي خلايا تعتمد على الرسو. الجزء الأكثر تحديا من هذا البروتوكول، هو الطباعة الدقيقة.

قبل بداية البروتوكول، والطباعة الدقيقة على الركيزة باستخدام فلورسنت للإشارة إلى البروتين للتحقق بصريا من الطباعة النهائية للنقش. تبدأ من خلال خلط بقوة في قاعدة PDMS مقويات والعوامل المعالجة مع طرف ماصة حتى يتم تفريق فقاعات متجانسة داخل الخليط. ثم إزالة الفقاعات مع فراغ desiccation.

ضع قطرة من خليط PDMS المجفف على غطاء مربع أو دائري، وتناوب على غطاء على معطف تدور في 2، 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. احتضان الغطاء في فرن إما في 60 درجة مئوية، لمدة ساعة إلى ساعتين، أو في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. لإعداد الركيزة منقوشة الصغرى، وضع رقاقة السيليكون منقوشة داخل دائرية قطرها 150 ملليمتر من قبل 15 ملليمتر ارتفاع طبق بيتري وصب دي الغاز PDMS على رقاقة.

توطدت PDMS في فرن في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها. السماح لPMS لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم استخدام مشرط الجراحية لخفض الطوابع من 30 من قبل 30 ملليمتر المربعات التي تحتوي على أنماط الصحيح مع الحرص على عدم تلف رقاقة السيليكون.

تعقيم الطوابع PDMS وزلات غطاء قابل للضبط عن طريق غمرها في 70٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة. لتأكيد فعالية micropattern، جفف سطح الطوابع PDMS باستخدام تيار الهواء المصفاة والماصات 15 ميكروغرام لكل ملليلتر BSA حل لتغطية الجانب الكامل منقوشة من الطابع. احتضان الطوابع مع حل BSA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة للسماح لامتزاز البروتين، ثم الهواء الجافة الطوابع لإزالة الحل BSA.

استخدم تيار الهواء الذي تمت تصفيته لتجفيف سطح قسائم الغطاء القابلة للتوابل. جعل الجانب منقوشة من الطابع في اتصال المطابقة مع غطاء قابل للتقريب للسماح لSA الامتزاز على سطح غطاء، واضغط بلطف على ختم ضد غطاء لمدة خمس دقائق. فحص micropattern باستخدام المجهر الفلوري مع مرشح FITC.

لطباعة مناطق لاصقة الخلية بدلا من أنماط الفلورسنت استبدال اللامينين لبروتين BSA. إزالة الطوابع من قسائم الغلاف ونقل زلات الغطاء إلى لوحة ستة جيدا معقمة. إضافة ملليلترين من 0.2٪ Pluronic F-127 حل في كل بئر لتغطية سطح زلة الغطاء واحتضان لوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

التعرق حل F-127 وغسل الغطاء زلات خمس مرات مع برنامج تلفزيوني، مرة واحدة مع ثقافة الخلية المتوسطة، ثم بذور الخلايا Schwann في كثافة البذر من 1000 خلية لكل سنتيمتر مربع. بعد 45 دقيقة من بذر الخلية، قم بإزالة خلية ثقافة المتوسطة وغسل الغطاء ينزلق مرتين مع PBS لمنع الخلايا المتعددة من الالتزام بنفس النمط. الحفاظ على الخلايا في بيئة ثقافة الخلية المطلوبة لمدة 48 ساعة قبل القياس الكمي.

لإنشاء ركائز لثقافة الخلية منقوشة بخط لفحص الخلايا المحاذية، قم بعمل الطوابع وفقًا لاتجاهات المخطوطة، وقطعها إلى الأبعاد المطلوبة. إعداد اثنين من أطباق بيتري المغلفة مع سطح PDMS قابل للتضبط كما هو موضح سابقا، وتنفيذ الطباعة الدقيقة لطباعة المناطق لاصقة الخلية منقوشة بخط على أحد الأطباق. بعد إزالة الطوابع، وملء طبق بيتري مع أربعة ملليلتر من 0.2٪ حل F-127 Pluronic واحتضانه لمدة ساعة.

شطف كل جانب من ختم PDMS ثلاث مرات مع 70٪ الإيثانول وتجفيفه بالهواء. قم بتدوير الطوابع PDMS وطباعة منطقة لاصقة الخلية غير المُغَرَد عليها على طبق بيتري الثاني كما هو موضح سابقًا. بعد احتضان الأطباق مع حل F-127، وإزالة الحل وغسل الأطباق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ومرة واحدة مع ثقافة الخلية الطازجة المتوسطة.

ثم بذور الخلايا على الأطباق، والحفاظ عليها في الظروف المطلوبة لمدة 48 ساعة قبل إعداد lysates. لتحضير الـ 80 من محلول RIPA، أعد وفقاً لاتجاهات المخطوطة، على كل منطقة لاصقة من الخلايا، ثم قم باحتضان الخلايا على كتلة ثلج لمدة 25 دقيقة. كشط الخلايا Schwann مع مكشطة الخلية لمدة خمس دقائق وجمع lysate في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر المسمى.

الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12 آلاف مرة G وأربع درجات مئوية. جمع المغرور ونقله إلى أنبوب تنظيف microcentrifuge. أدّت ركائز لامينين المغلفة إلى ارتفاع معدل الانتشار عند مقارنتها بالكولاجين والركائز المغلفة بالليفي.

وأظهرت خلايا شوان على ركائز مع طلاء اللامينين وتختلف مودولي أن ركائز ليونة نسبيا انخفاض معدلات انتشار الخلايا. كما تم تحليل الخلايا للتعبير البروتيني. تم رفع مستوى العامل النسخي c-Jun التعبير حيث أصبحت ركائز أكثر ليونة.

ومع ذلك ، كان إلى حد كبير downregulated على أنعم ركائز. على ركائز قاسية، الكولاجين ركائز المغلفة أسفرت عن أعلى تعبير ج يونيو، كما أصبحت ركائز ليونة، وأظهرت laminin أعلى مستويات ج يونيو. ثم كانت تلطخت الخلايا مع رودامين-phalloidin لاستكشاف دور انتشار الخلايا ومنطقة في التعبير C-يونيو.

عندما تم إنشاء خطوط لاصقة الخلية على ركائز ثقافة الخلية، وزيادة نسبة الارتفاع النووي للخلايا المصنفة على الركيزة نمط بالمقارنة مع تلك الخلايا على ركائز غير متفرعة. تم رفع تنظيم التعبير عن كل من مستقبلات c-Jun و p75 العصبية في الخلايا الكثيفة مع منطقة انتشار أصغر. كما أدت الخلايا المنقوشة بخط إلى تعبير أعلى لكل من c-Jun و p75 NTR بالمقارنة مع الخلايا غير المُتَرَكَّة.

تم إنشاء هندسات لاصقة الخلايا المطبوعة Microcontact للتحكم بدقة في منطقة انتشار الخلايا وامتدادها مع القضاء على تفاعلات الخلايا. وتسببت زيادة نسبة الارتفاع إلى الارتفاع الخلوي في زيادة المدة النووية. وكان التعبير عن ج يونيو upregulated عن طريق كل من الاستطالة الخلوية وتثبيط انتشار الخلايا.

وأكد تلطيخ الفلوروسين المناعي لكل من النوى والزنبق أن منطقة انتشار الخلايا والتسامي تم التحكم فيها بدقة من خلال هذه الطريقة micropatterning. مهدت هذه التقنية طريقة لاستخدام ركائزنا القابلة للتواؤم كوسيلة لتحليل بيولوجيا خلية شوان بطريقة ميكانيكية والإشارة في سياق التجديد والسرطان.