مراقبة وظيفة الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرة في شرائح أنسجة البنكرياس الحية
أبريل 12, 2021
تقدم هذه الدراسة تطبيق شرائح أنسجة البنكرياس الحية لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرية.
سيساعد بروتوكولنا في الإجابة على تأثير تفاعلات الخلايا المناعية على وظائف الجزيرة. طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية يسمح لعلم وظائف الأعضاء الجزيرة ووظيفة لدراسة مع الحفاظ على الأنسجة الكامنة وراء الأمراض والبيئة الدقيقة الأصلية. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على عمليات المرض لأمراض البنكرياس، مثل التهاب البنكرياس، ومرض السكري من النوع الأول، ومرض السكري من النوع الثاني.
للبدء، ترتيب الكتل على حامل العينة بطريقة لا تتجاوز عرض النصل، وضمان أن النصل يمكن أن تتحرك إلى الأمام أقل مسافة ممكنة عندما يتحرك هزاز ببطء. تطبيق خط من الغراء السوبر على حامل العينة، مما يجعل طبقة رقيقة باستخدام نهاية موزع الغراء، ثم الوجه كتل الأنسجة على الغراء بحيث الجانب القريب من الأنسجة يواجه صعودا. دفع بلطف أسفل الكتل والسماح للغراء الجاف لمدة ثلاث دقائق.
بعد ذلك ، قم بتوصيل اللوحة بالهزاز مع المسمار وضبط ارتفاع النصل والمسافة التي يتم قطعها بحيث يتحرك النصل على طول الكتل وبالكاد فوقها. دفع بلطف كتل مع ملقط للتأكد من أن الغراء قد جفت، ومن ثم ملء صينية هزاز مع محلول خارج الخلية المبردة حتى يتم تغطية النصل. تعيين هزاز لجعل شرائح من سمك 120 ميكرومتر والبدء فيه، ثم مراقبة شرائح الخروج من كتل الأنسجة.
رفع شرائح عندما تطفو قبالة كتلة عن طريق وضع فرشاة الطلاء أو ملقط تحتها ووضع شرائح في العازلة بيكربونات كريبس رينغر التي تحتوي على ثلاثة ملليمولار D-الجلوكوز ومثبطات تريبسين. ضع اللوحات التي تحتوي على الشرائح على الروك واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة في 25 دورة في الدقيقة. إذا كانت الشرائح تحتاج إلى الاحتفاظ بها لفترة أطول، ضع الشرائح في 15 ملليلتر من شريحة الثقافة المتوسطة ووضع لوحة في حاضنة.
احتضان الشرائح المعدة في 37 درجة مئوية للدراسات في نفس اليوم أو نقل الشرائح التي يتم استزراعها في 24 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التجربة. قم بتشغيل المجهر قبل ساعة واحدة على الأقل من التسجيل وتوازن حاضنة المرحلة العليا إلى 37 درجة مئوية. تأمين غطاء الزجاج أسفل طبق بيتري التي تحتوي على شريحة على خشبة المسرح.
ركز المجهر عن طريق وضع هدف 10X في وضع brightfield وحدد موقع الجزر باستخدام وضع الحقل الساطع من خلال البحث عن بيضاويات برتقالية اللون اللون داخل الشريحة. قم بتبديل المجهر إلى التصوير البؤري عن طريق الضغط على زر CS على وحدة تحكم الشاشة التي تعمل باللمس بالمجهر. لعرض الجزر باستخدام العاكسة، قم بتشغيل كاشف الليزر 638 وكاشف PMT.
تعيين طاقة الليزر بين واحد و 2٪وإيقاف مرشحات الشق. استخدم ليزر 405 نانومتر وكاشف PMT لمراقبة بقعة الحمض النووي. الكاشف الهجين للكشف عن الأجسام المضادة CD8 وكاشف الليزر والهجين 488 نانومتر لعرض رباعي الأنسولين.
مركز جزيرة الاهتمام في مجال الرؤية باستخدام المقابض X و Y من وحدة تحكم المرحلة. بمجرد أن تقع جزيرة ذات أهمية ، قم بالتبديل إلى هدف 20X وتكبيرها بحيث تشغل الجزيرة معظم الإطار. اتخاذ z-كومة من الجزيرة، ثم العثور على أفضل المقاطع البصرية حيث إلى الخلايا على قيد الحياة وأي الخلايا المناعية المحيطة بها هي في التركيز.
قم بتعيين المجهر للتسجيل في وضع XYZT وتحسين الإعدادات لتسجيل كومة z من الخطوات المحددة كل 20 دقيقة على مدى عدة ساعات. تم تصور الجزر في شريحة أنسجة البنكرياس باستخدام برايتفيلد وعكس المجهر الخفيف. الأنسولين في الجزر يزيد من التفاصيل ويسبب امتصاص كميات كبيرة من الضوء المنعكس، مما يزيد من رؤية الجزر.
تم تقييم صلاحية شريحة أنسجة البنكرياس البشرية الحية عن طريق التلطيخ. ويشار إلى الخلايا الحية باللون الأخضر والخلايا الميتة باللون الأزرق. مؤشر إيجابي آخر لقابلية البقاء هو النشاط القاعدي الملحوظ.
عندما تم تحميل شريحة البنكرياس الحية مع مؤشر الكالسيوم نفاذية الخلية, لوحظ تحفيز الجلوكوز في كل من الماوس وشرائح البنكرياس البشري. كما تم قياس مضان الخلايا الفردية أثناء تحفيز الجلوكوز كميا. لوحظت الجزر السليمة والمرضى باستخدام تلطيخ dithizone وينعكس المجهر الخفيف.
الجزر المريضة تبدأ في فقدان الحبيبية بسبب تسلل الخلايا المناعية وموت الخلايا. يمكن التعرف على مجموعات الخلايا المناعية باستخدام الأجسام المضادة CD8 وتلطيخ رباعي الأنسولين. يشير التلطيخ المشترك إلى أن الخلايا هي خلية تي تأثيرية تستهدف على وجه التحديد مستضد الأنسولين.
الشيء الأكثر أهمية أن نتذكر في هذا الإجراء هو الحفاظ على شرائح في الحلول مثبطات بروتياز في جميع الأوقات. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء العديد من الوظائف في تجارب الخلايا المناعية مما يسمح بدراسة تأثير تفاعلات الخلايا المناعية ووظيفة الجزيرة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تطبيق شرائح أنسجة البنكرياس الحية لدراسة فسيولوجيا الجزر وتفاعلات الجزر مع الخلايا المناعية. وتسمح هذه الطريقة بفحص وظائف الجزر مع الحفاظ على البيئة الدقيقة الأصلية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
خلفية علمية
- تلعب خلايا الجزر دوراً حاسماً في استقلاب الجلوكوز.
- يمكن لتفاعلات الخلايا المناعية أن تؤثر على وظيفة الجزر.
- يعد فهم هذه التفاعلات أمراً حيوياً لمعالجة أمراض البنكرياس.
- تحافظ شرائح الأنسجة الحية على السياق الفسيولوجي للخلايا.
الغرض من الدراسة
- لبحث تأثير تفاعلات الخلايا المناعية على وظائف الجزر البنكرياسية.
- لتوفير رؤى حول أمراض البنكرياس مثل داء السكري من النوع الأول والنوع الثاني.
- لتطوير طريقة تحافظ على الأمراض النسيجية والبيئات الدقيقة.
الطرق المستخدمة
- تحضير شرائح حية من أنسجة البنكرياس.
- استخدام جهاز الفايبراتوم (vibratome) لتقطيع دقيق.
- استخدام الغراء الفائق (super glue) لتثبيت كتلة الأنسجة.
- مراقبة التفاعلات بين الجزر البنكرياسية والخلايا المناعية في الوقت الفعلي.
النتائج الرئيسية
- تحافظ طريقة شرائح أنسجة البنكرياس الحية بفعالية على فيزيولوجيا الجزر البنكرياسية.
- تبين أن تفاعلات الخلايا المناعية تؤثر بشكل كبير على وظيفة الجزر البنكرياسية.
- يتيح هذا النهج دراسة المسببات المرضية الكامنة.
- يمكن للرؤى المكتسبة أن تساهم في تطوير استراتيجيات علاج أمراض البنكرياس.
الاستنتاجات
- تُعد شرائح أنسجة البنكرياس الحية أداة قيمة لدراسة فسيولوجيا الجزر البنكرياسية.
- يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهم التفاعلات المناعية في وظيفة الجزر البنكرياسية.
- يمكن للأبحاث المستقبلية أن تستند إلى هذه النتائج لمعالجة اضطرابات البنكرياس.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح شرائح أنسجة البنكرياس الحية الملاحظة المباشرة للتفاعلات بين الخلايا الجزرية والخلايا المناعية ضمن بيئة دقيقة أصلية ومحفوظة، مما يوفر نظاماً ذا صلة فسيولوجياً للحد من المخاطر الميكانيكية عند التحقق من أهداف علاج السكري. يدعم هذا النهج الثقة التنبؤية من خلال الحفاظ على حيوية الأنسجة والاعتلالات المرضية الكامنة مثل السكري من النوع 1 والنوع 2، مما يسمح لفرق البحث والتطوير بتقييم الفرضيات العلاجية في سياق مرتبط بالمرض. وتعمل هذه الطريقة كجسر بين بيولوجيا الاكتشاف والأبحاث الانتقالية من خلال توفير قراءات كمية وفي الوقت الفعلي لوظيفة الجزر وديناميكيات الخلايا المناعية، وهي أمور حاسمة لاتخاذ قرارات المتابعة أو الإيقاف في المراحل المبكرة من اكتشاف أدوية السكري.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تصور ارتشاح الخلايا المناعية وتأثيره المباشر على سلامة حبيبات الجزر وإفراز الإنسولين.
- القيمة التشغيلية: تحافظ على البنية الأصلية للأنسجة والتفاعلات الخلوية، مما يقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الأهداف الخاصة بعلاجات السكري المعدلة للمناعة.
- القيمة التنبؤية: تدعم عملية فرز المحفظة العلاجية من خلال ربط نشاط الخلايا المناعية بتدهور وظائف الجزر، مما يوفر قراءة متوافقة مع المؤشرات الحيوية لمدى الارتباط بالهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد قراءات فلورية كمية من مؤشرات الكالسيوم وتلوين رباعيات الإنسولين لتقييم تأثيرات المركبات المعتمدة على الجرعة على وظيفة الجزر البنكرياسية.
- القيمة التشغيلية: توحيد بروتوكولات تحضير الأنسجة والتصوير، مما يضمن قياسات أساسية قابلة للتكرار عبر التشغيلات التجريبية والأنظمة النموذجية.
- القابلية للتوسع: متوافق مع المجهر الفاصل الزمني (time-lapse microscopy) واكتساب الصور مكدسة المحور z (z-stack acquisition)، مما يتيح المراقبة الطولية لديناميكيات الخلايا المناعية على مدار عدة ساعات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يحافظ على الأمراض الكامنة في أنسجة البنكرياس البشرية والفأرية، مما يسمح بدراسة آليات مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 في نظام يحاكي الحالة المرضية.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط نتائج الاكتشافات المبكرة بالتحقق قبل السريري من خلال الحفاظ على التفاعلات بين الخلايا الضرورية لخلل وظائف الجزر الذي يتوسطه الجهاز المناعي.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يتيح تصور تفاعلات الخلايا التائية المؤثرة مع مستضدات الإنسولين عبر التصبيغ المشترك لـ CD8 و insulin tetramer، مما يدعم اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف بناءً على الآلية.
تكامل المسار وسير العمل
تندرج طريقة شرائح أنسجة البنكرياس الحية ضمن سلسلة الاكتشافات بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى الأبحاث قبل السريرية، حيث توفر نظاماً ملائماً للمرض يحافظ على حيوية الأنسجة والبيئة الدقيقة لإجراء الدراسات الميكانيكية للتفاعلات بين الجزر المناعية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال تمكين الملاحظة في الوقت الفعلي لتأثير الخلايا المناعية على فسيولوجيا الجزر، مما يوضح المسارات المتضمنة في إمراض السكري.
- الفحص: توفر شرائح نسيجية جاهزة للمقايسة مع مخرجات كمية لتدفق الكالسيوم المحفز بالجلوكوز وارتباط رباعي الإنسولين، مما يسهل التقييم الموثوق للمركبات.
- التحليلات: تولد بيانات زمنية XYZT ومقاطع بصرية z-stack، مما يسمح للفرق بقياس الاستجابات الخلوية وتمركز الخلايا المناعية بمرور الوقت.
- الأبحاث الانتقالية: تحافظ على الاعتلالات ذات الصلة بالمرض والبيئة الدقيقة الأصلية، مما يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من آليات التعديل المناعي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة وظيفة الجزر عبر نماذج مرضية وأنماط علاجية متعددة، مما يقلل من التكرار في تطوير النماذج.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي من خلال التصوير المباشر للتفاعلات بين الجزر والمنظومة المناعية في الأنسجة السليمة.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار عبر بروتوكولات محكومة للتقطيع والحضن والتصوير تحافظ على حيوية الشريحة ووظيفتها.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال ربط نشاط الخلايا المناعية بتدهور وظيفة الجزر، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من تطوير أدوية السكري.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات للمرشحات المعدلة مناعياً بناءً على تقييم المخاطر وقدرتها على تخفيف خلل وظائف الجزر الناجم عن المناعة في نظام يحاكي المرض.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في التعامل مع الأنسجة، والتقطيع بجهاز الفايبراتوم (vibratome)، والمجهر البؤري (confocal microscopy) للتصوير الحي لديناميكيات الخلايا المناعية.
- تعتمد على أجهزة تشمل جهاز الفايبراتوم، ومجهر بؤري مزود بكواشف ليزر (405nm, 488nm, 638nm)، وحاضنة فوق المنصة للتحكم البيئي.
- تستلزم توحيد المعايير بين الفرق في تحضير الشرائح، وتكوين المحلول المنظم (محلول Krebs-Ringer bicarbonate مع D-glucose ومثبط التربسين)، وظروف الحضن لضمان إمكانية تكرار النتائج.
- تتضمن اعتبارات التكييف عند تطبيق الطريقة على أنظمة نماذج مختلفة (البشر مقابل الفئران) أو حالات مرضية مختلفة (T1D مقابل T2D) للحفاظ على حيوية الأنسجة والأهمية المرضية.
- تشمل قيوداً عملية مثل الحاجة إلى مثبطات البروتياز للحفاظ على سلامة الشرائح، والتحدي التقني المتمثل في الحفاظ على الوضوح البصري أثناء التصوير الزمني الممتد لفترات طويلة.
