تحليل أنماط حركية السدادة أثناء وبعد تجديد الجهاز الفموي باستخدام تتبع الخلايا
أبريل 26, 2021
نقدم بروتوكولا لتوصيف حركية وسلوك مجموعة من مائة خلية بحجم ميكرون إلى ملليمتر باستخدام المجهر الساطع وتتبع الخلايا. يكشف هذا الفحص أن Stentor coeruleus ينتقل عبر أربع مراحل متميزة سلوكيا عند تجديد جهاز فموي مفقود.
منذ فترة طويلة تم استخدام Stentor coeruleus ككائن حي نموذجي لفهم التجديد أحادي الخلية. في حين أن الجدول الزمني للتجديد المورفولوجي البصري معروف ، إلا أن الجدول الزمني للتجديد الوظيفي لا يزال غير معروف. يتتبع هذا الفحص حركية سكان المركز الذين يخضعون للتجديد المتزامن بحيث يمكن تحديد وظيفة استرداد الخسارة.
يمكن تكييفه للاستخدام مع أنواع الخلايا الأخرى. سيؤدي عدم وجود ختم آمن لغرفة التصوير إلى تسرب الآبار إلى بعضها البعض أو تشكل فقاعات الهواء داخل الآبار. بالنسبة للباحثين غير المطلعين على استخدام فواصل السيليكون ، نوصي بشدة بأن يتم سحب PSW أو أي وسيط نظيف آخر في كل بئر من الآبار لاختبار التسرب قبل الاستخدام.
يتم عرض بناء غرف العينة بشكل أسهل من وصفه شفهيا. كما هي عملية استخراج أنماط الحركة من بيانات الفيديو المكتسبة. للبدء ، قم بقطع قطعة من ورقة فاصل السيليكون بسماكة 250 ميكرومتر أصغر قليلا في كل من الارتفاع والعرض من شريحة المجهر.
استخدم لكمة كاملة لإنشاء آبار دائرية تترك مساحة كافية بين الآبار المجاورة لضمان ختم جيد. بدء تجديد الجهاز الفموي عن طريق احتضان الخلايا المنتفخة coeruleus في 10٪ السكروز أو 2٪ uria لمدة دقيقتين. ثم يغسل ثلاث مرات مع وسط طازج.
ماصة بلطف ما يقرب من 10 دعامات في كل بئر. الحرص على مطابقة حجم العينة مع حجم البئر قدر الإمكان. أغلق الآبار عن طريق خفض قطعة من زجاج الغطاء برفق فوق الآبار بدءا من حافة واحدة.
استخدم جسما ضيقا ومرنا قليلا ، مثل طرف ماصة 10 ميكرولتر للضغط لأسفل على زجاج الغطاء حيث يلامس ورقة السيليكون لضمان ختم جيد. ضع العينة على مرحلة المجهر واضبط المجهر على أدنى تكبير متاح بحيث يتناسب المرء بشكل جيد مع الإطار. ابدأ الفاصل الزمني واحصل على فيديو مدته عشر ثوان بمعدل 30 إطارا في الثانية من كل بئر في كل نقطة زمنية.
للمعايرة، احصل على صورة واضحة لشريحة معايرة أو مسطرة واضحة في نفس إعدادات التكبير مثل مقاطع الفيديو. باستخدام أي برنامج لعرض الصور ، قم بحساب عدد وحدات البكسل بين علامات المسافة المادية المعروفة. قم بتنزيل البرنامجين النصيين وخلايا التتبع وتنظيف الآثار إلى موقع يسهل تذكره على الكمبيوتر ونقل مقاطع فيديو البيانات إلى هذا الكمبيوتر أيضا.
تنظيم مقاطع فيديو البيانات في مجلدات. واحد لكل نقطة زمنية. استخدم خلايا تتبع البرنامج النصي لإجراء تتبع تلقائي للخلايا في مقاطع فيديو البيانات عن طريق فتح خلايا المسار وتشغيل البرنامج النصي اختر إضافة إلى المسار "إذا طلب منك ذلك من خلال نافذة منبثقة والتي لن تحدث عادة إلا عند تشغيل البرنامج النصي لأول مرة من مجلد معين.
عند المطالبة، حدد مقطع فيديو بيانات واحدا أو أكثر لبدء التتبع. انتقل إلى مقاطع فيديو البيانات وبمجرد الرضا عن قائمة الملفات ، انقر فوق فتح"لرفض الآثار الشاذة أو الخاطئة يدويا ، افتح الآثار النظيفة في نافذة محرر MATLAB بالنقر المزدوج على الملف. في المطالبة ، حدد إخراج مجلد البيانات بواسطة خلايا التعقب.
انتقل إلى أحد المجلدات التي تم إنشاؤها وحدده. عند المطالبة، أدخل واحدا للاحتفاظ بالتتبع وصفرا لرفض التتبع. ثم اضغط على Enter للانتقال إلى التتبع التالي.
ابدأ بتنزيل البرنامج النصي بعنوان مؤامرات السباغيتي. افتح البرنامج النصي وقم بتشغيله. عندما تنبثق نافذة مستعرض الملفات مع المطالبة، حدد المجلد المراد فتحه.
انتقل إلى مجلد إحدى النقاط الزمنية. عند المطالبة، المعايرة، ما هو عدد وحدات البكسل لكل ملليمتر؟ اكتب قيمة المعايرة واضغط على مفتاح الإدخال Enter.
اضبط محاور المؤامرة حسب الضرورة عن طريق تغيير السطر 55 من البرنامج النصي ، والذي يتم تعيينه افتراضيا إلى RR يساوي أربعة. لتضمين دائرة نصف قطرها تصل إلى أربعة ملليمترات. حفظ المؤامرة.
تظهر النتائج الحركة الجماعية لسكان الخلايا الجذعية في ساعتين وثلاث وسبع وثماني ساعات من عملية تجديد الجهاز الفموي. تظهر هذه المؤامرات كلا من الزيادة المتوقعة في عدد الأفراد المتحركين والزيادة أربعة أضعاف في نطاق الخلايا الأكثر حركة داخل السكان. أسرع خلايا السباحة ، إذا بدأت بالقرب من الحافة ، يتم تقييدها من السباحة بالكامل في خط مستقيم ويبدو نطاق حركتها أصغر.
تم تصنيف خلايا المسالك إلى ثلاث فئات متميزة ، غير متحركة مع عدم وجود ثبات مرئي ، وغير متحركة مع ثبات مرئي ، ومتحركة. أظهرت النتيجة رسما بيانيا مكدسا يلخص عدد الخلايا النسبية عبر هذه الفئات كدالة لنا في التجديد. في أوقات لاحقة ، تم العثور على عدد كبير من الخلايا في مستعمرات ذات صيام مرئي يشير بقوة إلى أنها استكشفت البيئة وربطت بشكل تفضيلي بالقرب من الآخرين من نوعهم.
من المهم اختيار أبعاد بئر العينة التي تعمل بشكل جيد مع coeruleus السدادة التي يبلغ حجمها حوالي ملليمتر واحد. ويشمل ذلك سمك فاصل السيليكون 5/16 بوصة في القطر ، و 10 خلايا لكل بئر. يجب ضبط هذه الأرقام عند تكييف هذا البروتوكول مع أنواع الخلايا الأخرى.
يمكن إجراء هذا الفحص بالاقتران مع RNA-I للتحقيق في تجديد الأنماط الظاهرية المختلفة للدعامات ومقارنتها.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة اختباراً لقياس حركية Stentor coeruleus خلال تجدد الجهاز الفموي (OA). ومن خلال مزامنة عملية التجدد وتتبع حركة الخلايا بمرور الوقت، يتيح هذا البروتوكول تحليلاً مفصلاً للتعافي الوظيفي والتغيرات السلوكية في كائن نموذجي وحيد الخلية. وتجمع هذه الطريقة بين غرف تصوير مخصصة، والمجهر بنظام التصوير الزمني (time-lapse microscopy)، والتحليل الآلي للفيديو لتوفير إحصائيات دقيقة حول الحركية عبر مجموعات خلوية كبيرة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- بيولوجيا التجدد
- التحليل السلوكي للكائنات أحادية الخلية
خلفية علمية
- Stentor coeruleus هو نموذج كلاسيكي لدراسة التجديد في الكائنات وحيدة الخلية.
- بينما تم تحديد الجداول الزمنية للتجديد المورفولوجي، فإن الجداول الزمنية للاستعادة الوظيفية أقل فهمًا.
- كشفت الدراسات الترانسكريبتومية عن تنظيم جيني معقد أثناء التجديد، مما يشير إلى إعادة تنظيم خلوية جهازية.
- هناك حاجة إلى مقايسات كمية لربط مراحل التعبير الجيني بالتغيرات السلوكية.
الغرض من الدراسة
- تطوير واستعراض مقايسة لتقدير الحركة كمياً أثناء تجديد العضو المعتل (OA) في S. coeruleus.
- رصد المقياس الزمني وإحصائيات تغيرات الحركة أثناء عملية التجديد.
- توفير أداة قابلة للتكيف لفحص الأنماط الظاهرية للحركة في أنواع خلوية أخرى.
الطرق المستخدمة
- بناء غرف تصوير مخصصة باستخدام فواصل من السيليكون وزجاج غطاء لإنشاء آبار محكمة الإغلاق.
- تحفيز تجديد OA عن طريق تحضين الخلايا في 10% sucrose أو 2% urea، يليه الغسل.
- الالتقاط الزمني لمقاطع الفيديو في فواصل زمنية محددة باستخدام مجهر منخفض التكبير.
- تتبع الخلايا آلياً وتنظيف المسارات باستخدام سكربتات MATLAB مخصصة.
- تصنيف حالات حركية الخلايا والتحليل الإحصائي لسلوك المجتمع الخلوي بمرور الوقت.
النتائج الرئيسية
- عند فقدان OA، تفقد S. coeruleus في البداية الحركة الموجهة.
- لوحظ انخفاض كبير في سرعة السباحة بين ~4 و ~8 ساعات بعد التحفيز.
- تزداد أنماط ومدى الحركة مع تقدم عملية التجدد، مع زيادة بمقدار أربعة أضعاف في مدى الخلايا الأكثر حركة.
- صُنفت الخلايا إلى فئات غير متحركة (مع/بدون عضو تثبيت) وفئات متحركة؛ وتظهر النقاط الزمنية اللاحقة زيادة في تكوين المستعمرات واستكشاف البيئة.
الاستنتاجات
- يوفر هذا الاختبار إطاراً كمياً لدراسة التجدد الوظيفي في الكائنات وحيدة الخلية.
- ترتبط التغيرات في القدرة على الحركة بمراحل التجدد، ويمكن ربطها بديناميكيات التعبير الجيني الكامنة.
- يتميز هذا البروتوكول بقابليته للتكيف مع أنواع أخرى من الخلايا، ويمكن دمجه مع نهج الاضطراب الجيني مثل RNAi.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التحليل الكمي للحركية أثناء تجديد الجهاز الفمي في Stentor coeruleus التوصيف المظهري الوظيفي للتعافي الخلوي، مما يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة. ويوفر هذا المقايسة منصة قابلة للتوسع لربط ديناميكيات التعبير الجيني بالمخرجات السلوكية الملحوظة، مما يعزز الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف والمسح المظهري. كما أن قابليتها للتكيف مع أنواع أخرى من الخلايا تجعل منها قدرة قابلة لإعادة الاستخدام في مبادرات البحث والتطوير عبر مختلف المحافظ البحثية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يُتيح استقصاء الجداول الزمنية للتعافي الوظيفي في أعقاب الاضطراب المستهدف.
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال التحديد الكمي للنتائج المظهرية لمراحل التنظيم الجيني.
- يُسهل الثقة التنبؤية في ربط الأحداث الجزيئية بسلوكيات الخلية الملحوظة.
- يوفر منصة للتحليل المقارن عبر الخلفيات الجينية أو التدخلات المختلفة.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر مقاييس حركية كمية وموحدة للفحص المظهري عالي المحتوى.
- يتيح تصنيفاً قابلاً للتكرار لحالات الحركية عبر مجموعات خلوية كبيرة.
- يدعم إمكانية توسيع نطاق المقايسة وتكييفها مع نماذج متنوعة من الكائنات وحيدة الخلية أو النماذج الصغيرة متعددة الخلايا.
- يجهز أنظمة بيولوجية مصدق عليها لسير عمل الفحص الوظيفي أو الجيني اللاحق.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط التوصيف المظهري الوظيفي بالبيانات الترانسكريبتومية والجزيئية لضمان الاستمرارية الانتقالية.
- يتيح اتخاذ قرارات تقدم مدروسة بناءً على المخاطر من خلال قياس نقاط النهاية السلوكية ومعدلات التعافي.
- يدعم الحد من المخاطر الميكانيكية في عملية اختيار النماذج قبل السريرية والتحقق من صحتها.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل مقايسة تتبع الحركة هذه ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار الفرضيات المبكرة، ووصولاً إلى الفرز المظهري والتحقق من صحة النماذج قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: قياس التعافي الوظيفي والتغيرات السلوكية المرتبطة بمراحل التعبير الجيني.
- الفحص: توفير مخرجات كمية قابلة للتكرار للحركية من أجل التحليل المقارن.
- التحليلات: توليد قراءات إحصائية وتوزيعات الحركية على مستوى المجتمع لضمان مقارنة قوية بين الظروف.
- الأبحاث الترجمية: الربط بين البيانات الجزيئية والنمط الظاهري لتوجيه عملية اختيار النماذج قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام في المؤسسات: بروتوكول قابل للتكيف يدعم التطبيق الواسع عبر أنواع الخلايا والخلفيات الجينية المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في دراسات التعافي الوظيفي.
- القيمة التشغيلية: توحد التنميط الظاهري للحركية وتسمح بتوليد بيانات قابلة للتطوير والتكرار.
- القيمة الاستراتيجية: توجه قرارات المضي قدماً أو التوقف وتعزز كفاءة رأس المال من خلال ربط النهايات الجزيئية والسلوكية.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر وقرارات التطوير عبر البرامج المختلفة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الخلايا، والتصوير، والتحليل الكمي للبيانات.
- يتطلب الوصول إلى مجهر التصوير الزمني (time-lapse microscopy) وبنية تحتية حاسوبية للتتبع الآلي.
- يستلزم توحيد معايير بناء غرف التصوير ونصوص معالجة البيانات بين الفرق المختلفة.
- قد يتطلب التكيف مع أنواع أخرى من الخلايا تحسين أبعاد الآبار وكثافة الخلايا.
- يعد ضمان إحكام سدادات الغرفة أمراً بالغ الأهمية لمنع ظهور الشوائب التقنية والحفاظ على جودة البيانات.
