تقييم العصبية على الحركة باستخدام الخلايا الجذعية جل المستندة Agarose الأجهزة ميكروفلويديك

مرحباً، أنا كيفن وون، طالب ماجستير في الهندسة في مختبر السوائل الحيوية بجامعة كورنيل. وسأتحدث اليوم عن استخدام جهاز مائعات دقيقة قائم على مادة agarose لدراسة تأثير عامل نمو البشرة EGF على الخلايا الجذعية العصبية للفئران.

يتكون الجهاز بشكل أساسي من ثلاث قنوات مائعية دقيقة، يبلغ عرض كل منها 150 microns. يتم ضخ EGF في إحدى القنوات الجانبية، بينما يتم ضخ المنظم في القناة الجانبية الأخرى. يؤدي ذلك أساساً إلى إنشاء تدرج كيميائي خطي ثابت عبر القناة المركزية.

بما أن عامل نمو البشرة (EGF) ينتشر بسهولة عبر هلام الأجار، يتم استزراع الخلايا الجذعية العصبية في القناة المركزية ومراقبة تقدم هجرتها عبر المجهر. لذا، تتكون الأجهزة أساساً من طبقة علوية من البليكسي جلاس تحتوي على جميع المداخل والمخارج اللازمة للتوصيل بالأنابيب، وتحتها غشاء من هلام الأجار يحتوي على أربعة أجهزة ذات أنماط محددة.

يُحاط هذا بفاصل من الـ PDMS، مما يضمن الحفاظ على سماكة ثابتة في جميع أنحاء الجهاز بالكامل. يتم تجميع الـ PDMS والهلام على شريحة زجاجية مطلية بـ ect، مما يساعد الخلايا على الالتصاق بالشريحة الزجاجية.

بالإضافة إلى ذلك، تُستخدم لوحة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتثبيت الجهاز بأكمله، ونقوم بتثبيت الجهاز معاً باستخدام البراغي. تم ترنسفكشن السلالة الخلوية من النوع البري باستخدام ناقل فيروسي قهقري للتعبير المفرط عن مستقبل EGF من النوع البري، بينما تم ترنسفكشن السلالة الخلوية دلتا بنسخة طافرة من مستقبل EGF تمكنه من أن يكون نشطاً بشكل مستمر دون الحاجة إلى ربيطة EGF. حسناً، سأبدأ بشرح عملية تجميع جهاز الموائع الدقيقة الخاص بنا.

أولاً، قمت بوضع فاصل PDMS حول الميزات البارزة للقنوات الدقيقة السيليكونية في القوالب الرئيسية. والآن سأقوم بوزن 0.3 جرام من agros. ثم سأجلب 10 mils من وسط زراعي مستقل عن CO2 وأضيفه إلى agros.

سأقوم بعملية السحب والدفع بالمصّة لخلط مسحوق agros مع الوسط الغذائي المستقل عن CO2. الآن أصبحنا جاهزين لاستخدام الميكروويف. كما تلاحظون الآن، أصبح agros سائلًا، ولكن لا تزال هناك بعض الحبيبات المتبقية.

سأحاول تحريك هذا المزيج بشكل دائري لإذابة الحبيبات والتخلص من فقاعات الهواء. والآن أقوم بصب الـ agarose المنصهر فوق المعالم البارزة للقالب السيليكوني، ثم سآخذ شريحة زجاجية معقمة وأضعها فوق الفاصل المصنوع من الـ PDMS. وأضعها بزاوية مائلة لمحاولة دفع معظم فقاعات الهواء خارج الـ agarose gel.

لقد قمت بتسليط الضغط وسأستمر في ذلك حتى تتصلب قشرة الأجاروز. وبعد مرور دقيقة إلى دقيقتين، تكونت القشرة الصلبة. والآن سأقوم بإزالة الأجاروز الزائد من الشريحة.

تتمثل الخطوة التالية في سحب الشريحة الزجاجية برفق، ويمكن التخلص من هذه الشريحة الزجاجية. سأقوم الآن بمحاولة نقل أنماط agros برفق إلى شريحة زجاجية قمت بطلائها مسبقاً بـ fibronectin. أستخدم أساساً هذه الورقة البلاستيكية المعقمة لمساعدتي في رفع أنماط agros مع فاصل PDMS، وسأقوم بنقل أنماط agros بحيث تكون القنوات متجهة نحو الشريحة.

بعد أن أصبح هذا مثبتًا بإحكام على الشريحة الزجاجية، سأقوم بثقب ثقوب في الخزانات الفردية لتمكين الموزع البلاستيكي من الوصول إلى القنوات. سأفعل ذلك باستخدام خرامة ثقوب معدنية صغيرة. الآن انتهينا من ثقب الثقوب في الجهاز.

سأضيف 500 µL من الوسط الغذائي المستقل عن CO2 لمنع جفاف القنوات الدقيقة، وسأتركه الآن لمدة دقيقة إلى دقيقتين. حسنًا، بعد دقيقة إلى دقيقتين، سأحاول تصريف الوسط الزائد، والآن سأقوم بمحاذاة الثقوب التي تم ثقبها في نمط agros مع ثقوب المدخل والمخرج في مجمع البلكسي جلاس. وبمجرد محاذاة الثقوب، أضغط بقوة لتشكيل سداد محكم.

سأقوم الآن بوضع الموزع المصنوع من البلكسي جلاس فوق القواعد المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ، ثم سأقوم بتثبيت الجهاز معاً برفق باستخدام البراغي. سأحرص بشدة على عدم الإفراط في شد البراغي لأن ذلك سيؤدي إلى سحق القنوات، وسأقوم بتركيب البراغي باتجاه عقارب الساعة لمنع انزلاق هلام Agarose الموجود بالداخل. سأقوم بسحب 1 mL من الوسط الغذائي وسأستخدم هذه السرنجة لاختبار الجهاز.

وكما ترون، أقوم بحقن السائل في كل قناة دقيقة وأبحث عن خروج السائل من كل مخرج. وفي الوقت الحالي، قمت بوضع الجهاز المجمع داخل الغرفة البيئية للمجهر. يتم الحفاظ على هذه الغرفة عند 37 °C، مما سيؤدي إلى تدفئة الجهاز وتجهيزه للمرحلة التي سنحتاج فيها إلى استزراع الخلايا.

وكما ترون، لقد قمت بالفعل بتمرير أنبوبي مضخة البيرستالتيك عبر الجهاز. وأقوم حالياً بغسل الأنابيب باستخدام PBS تحضيراً لتجاربنا. والآن سنقوم بتجهيز الأنابيب.

سأقوم بتمرير أنابيب مضخة parasol عبر الأغطية التي تم ثقب ثقوب فيها مسبقاً. ويحتوي كل أنبوب على عدد محدد من الحزوز لتمكيني من تحديد كل من مدخل ومخرج الأنبوب. وبذلك، فإن الأنبوب الذي يحتوي على أربعة حزوز سيستقبل 10 nanogram per mil.

سيتم الآن توصيل أنابيب محلول EGF بالجهاز. سأقوم بتوصيل الأنبوب بكل جهاز بناءً على عدد الحزوز الموجودة به، ليتناسب ذلك مع كمية المحلول التي يمتصها.

والآن أقوم بتوصيل أنبوب المخرج. نحن نستخدم أنبوب tigon شفافاً للتأكد من أن الوسط يتدفق بالفعل عبر أنبوب المخرج وعدم وجود أي انسدادات في القناة. والآن سأقوم بتشغيل مضخات parasol.

سأبدأ الآن بإجراء استزراع الخلايا في القناة المركزية. سأبدأ بسحب الوسط الزائد من قناة الاستشعار. والآن سأقوم باستزراع الخلايا.

الخلايا موجودة بالفعل في حالة تعليق في وسط غذائي مستقل عن CO2. وقد قمت بوضع 60 ميكرولتر في مدخل القناة المركزية، ووضعت 20 µL في المخرج. ومن المؤمل أن تستقر الخلايا عن طريق التدفق المدفوع بالجاذبية.

وسأكرر هذا الإجراء للقناتين الحساستين الأخريين، وسنلاحظ ذلك الآن تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت عملية تثبيت الخلايا قد تمت بنجاح. الآن، التصقت الخلايا بالشريحة الزجاجية، وفي غضون دقائق قليلة ستبدأ في الانتشار واكتساب شكلها المورفولوجي الفريد. لقد غطينا اليوم تجميع الجهاز الفعلي، وتحضير الكواشف، والتقنيات المجهرية التي أستخدمها لتصوير هجرة الخلايا داخل الجهاز.

وفي الختام، نأمل أن يحظى هذا الجهاز بتطبيق أوسع نطاقاً، لا سيما في السياق السريري. يوضح الشكل 1 مسارات خلايا C 17.2 أفقياً، وتركيزات EGF المتزايدة رأسياً.

يوضح هذا الرسم مسارات السلالات المختلفة من خلايا C 17.2 التي استخدمناها في تجاربنا مع نفس تركيز EGF. وتظهر بيانات الخلايا الأبوية وجود ذروة في الحركة عند تدرج تركيز EGF بمقدار 10 nanogram per mil، مما يشير إلى أن المستقبلات قد تشبعت بالرابط عند تركيز EGF أعلى. بينما تظهر بيانات النوع البري زيادة في الحركة عند تركيز EGF بمقدار 100 nanogram per mil.

يشير هذا إلى أن المستقبلات لا تصل إلى حالة التشبع عند تركيزات EGF الأعلى. وهذا أمر منطقي لأن هذه الخلايا صُممت للتعبير المفرط عن مستقبل EGF. وأخيراً، تشير بيانات الخط الخلوي delta إلى أن حركية الخلايا مستقلة تقريباً عن تركيز EGF.

وهذا أمر متوقع أيضاً، حيث صُممت مستقبلات EGF الطافرة لتعمل بشكل مستقل عن وجود EGF.