تعديلات على طريقة Langendorff لعزل المتزامنة من الخلايا العضلية الأذيني والبطيني من الفئران الكبار

يمكن أن يساعد هذا البروتوكول على تحسين العائد الأذيني من قلب فأر متغلغل. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الخلايا العضلية الأذينية والبطينية يمكن عزلها في وقت واحد تحت نفس حالة الهضم. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لآليات أمراض القلب على المستوى الخلوي ودون الخلوي.

بعد القتل الرحيم لذكر يبلغ من العمر ثمانية إلى 10 أسابيع C57 أسود ستة فأر، استخدم ملقط الأنسجة لرفع جلد xiphoid. ثم باستخدام مقص الأنسجة، وجعل شق الجانبي طفيفة من خلال الجلد. إجراء تشريح حاد بين الجلد واللفافة.

تمديد شق الجلد نحو axillae في شكل V على كلا الجانبين ومواصلة شق من خلال القفص الصدري. ثم باستخدام ملقط الأنسجة، المشبك القص وحرف القفص الصدري صعودا لفضح كامل القلب والرئتين. باستخدام ملقط منحني، قشر قبالة التامور.

إذا كانت الغدة الصعترية تغطي الأوعية العظيمة ، فاستخدم ملقطين منحنيين لتمزيق الغدة الصعترية نحو كلا الجانبين ، ثم اسحب قاعدة القلب برفق نحو الذيل حتى تظهر الشريان الأورطي وشرايين فرعه كوعاء دموي على شكل حرف Y. عبر الشريان الأورطي في الشريان السباتي المشترك الأيسر، ثم قطع الشريان العضدي. استئصال القلب وتزج على الفور في طبق بيتري التي تحتوي على محلول تايرود لغسل وضخ الدم المتبقية.

ثم نقل القلب إلى طبق بيتري آخر يحتوي على حل واحد. تحت مجهر ستيريو، وذلك باستخدام مقص إيريس غرامة، تقليم أي فائض الأنسجة. طرد فقاعات الهواء من الحقنة.

ثم بمساعدة اثنين من ملقط ربط مستقيم، أداء cannulation الأبهري الرجعية، مع الحرص على أن يتم تنفيذ عملية التكعلبة بأكملها تحت سطح السائل. ضبط عمق القنية بحيث غيض القنية في الشريان الأورطي التصاعدي، مع الحرص على عدم اختراق الصمامات الأبهري. ثم مع خياطة ما قبل عقدة 3-O، ligate الشريان الأورطي إلى درجة القنية.

حقن بلطف حل واحد من الحقنة لطرد الدم المتبقي. ثم ربط القلب cannulated إلى جهاز Langendorff، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات الهواء في القلب. بعد ربط القلب المعلب بجهاز Langendorff ، يتغلغل القلب في الحل الأول لمدة دقيقتين تقريبا.

باستخدام ماصة البولي ايثيلين المعقمة ذات الاستخدام الواحد، رسم حوالي 2.5 ملليلتر من الحل ثلاثة وقبل الحرب عليه في حمام الماء لاستخدامها في وقت لاحق. ثم لهضم الأنسجة، يتغلغل القلب مع الحل المتبقي ثلاثة لمدة 11 إلى 12 دقيقة تقريبا. بعد أول دقيقتين من التشوه باستخدام الحل الثالث، قم بإعادة تدوير المحلول المتغلغل في الخزانات الثاوية بواسطة المضخة العتمة لإعادة استخدامها حتى يتم الانتهاء من الهضم.

عندما يصبح القلب منتفخا ، يتحول شاحبا قليلا ومترهلا ، باستخدام ملقط مسنن ، قرصة عضلة القلب بلطف. إذا كانت بصمة مرئية، وإنهاء الهضم وفصل القلب من الجهاز. لعزل الخلايا العضلية الشريانية البطينية، استخدم ملقط لإزالة البطينين والأتريا ووضعها في أطباق بيتري مختلفة.

ثم أضف الحل قبل تسخينها ثلاثة إلى كلا الطبقين. باستخدام ملقط حاد، triturate الأنسجة في نسيج عكر، ثم ماصة بلطف الأنسجة للهضم حتى دون إدخال فقاعات الهواء. لوقف نشاط الانزيم المتبقية، وذلك باستخدام ماصة، ونقل الأنسجة المهضومة العكر إلى الحل الرابع، ثم الطرد المركزي لمدة 20 ثانية في 192 مرة G.After إزالة supernatant، resuspend رواسب الخلية في الحل الخامس.

لتجنب مفارقة الكالسيوم والكالسيوم الزائد، إعادة إدخال الكالسيوم بطريقة تدريجية بإضافة ما مجموعه 50 ميكرولتر من 100 ملليمولار لكل لتر كلوريد الكالسيوم إلى تعليق الخلية. مرة واحدة وقد أضيفت كل كلوريد الكالسيوم، وتخزين الخلايا في حل تايرود لدراسة المشبك التصحيح. ويرتبط عمق العلبة مع تغلغل الأذينين وملحقاته.

عندما يكون طرف القنية في الشريان الأورطي الصاعد ، يتم تضخيم كلا الزوائد الأذينية مما يشير إلى تغلغل الأذينين الكافي. ومع ذلك ، عندما يكون طرف القنية في الجذر الأبهري ، يتم تزيين كلا الزوائد الأذينية ، مما يشير إلى عدم كفاية التشوه. وكان myocytes الأذينية المعزولة عن طريق التشنج في الشريان الأورطي الصاعد معدلات البقاء على قيد الحياة أعلى من تلك المعزولة عن طريق العلبة في الجذر الأبهري على حد سواء قبل وبعد إعادة إدخال الكالسيوم.

في المقابل، لم يكن هناك فرق في معدلات البقاء على قيد الحياة من الخلايا العضلية البطينية معزولة عن طريق التشنج إما في الشريان الأورطي الصاعد أو الجذر الأبهري قبل وبعد إعادة إدخال الكالسيوم. تسجيل المشبك التصحيح كامل الخلية من تيار الصوديوم في الخلايا العضلية الأذينية البطينية المعزولة، فضلا عن الكثافات الحالية تؤكد أن نوعية الخلايا المعزولة يلبي متطلبات التجارب الكهربية. عند تحويل الشريان الأورطي، تأكد من الاحتفاظ غدة كافية للربط.

خلاف ذلك ، قد تخترق القنية الصمام الأبهري بعد الربط.