A أسلوب الخطوة بخطوة لإعادة تشكيل ناقلة الى جزيئات الدهون ABC Nanodisc

الهدف العام من هذا الإجراء هو دمج ناقل من النوع A, b, C. في هذه الحالة، يتم دمج ناقل المالتوز malf GK two في جسيمات نانوية من الأقراص الغشائية الذائبة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق خلط بروتين السقالة الغشائية MSP أولاً مع الناقل والكمية المناسبة من الدهون في ميسيلات المنظفات.

تتمثل الخطوة الثانية في إضافة حبيبات البوليسترين وهز الخليط بلطف طوال الليل، حيث يتم امتصاص المنظف تدريجياً على الحبيبات، مما يسمح بتكوين جسيمات الأقراص النانوية. بعد ذلك، يتم إزالة الحبيبات عن طريق الترسيب. وتتمثل الخطوة النهائية في فصل الأقراص المتكونة بشكل صحيح عن التجمعات وبروتينات السقالة غير المتجمعة باستخدام كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي.

وأخيرًا، يتم تقييم جودة الأقراص عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي أو مطيافية تشتت الضوء. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى مثل الليبوزومات في أن البروتينات الغشائية والأقراص تكون ذائبة تمامًا في المحلول المائي. بالإضافة إلى ذلك، أصبحت نطاقات البروتين الآن متاحة من كلا الجانبين.

بما أنه لم يعد هناك مقصورة غشائية، فقد تمكنتُ، باستخدام بروتينات السقالة الغشائية ذات الأطوال المختلفة، من حصر ودراسة حالات الربط المختلفة للبروتينات الغشائية. والأهم من ذلك، أن هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بروتوميات الغشاء، مثل تحديد شركاء الارتباط الجدد لناقلات a وb وC. وفي الواقع، تمتد تطبيقات هذه التقنية إلىما هو أبعد من ذلك لتصل إلى العلاج، حيث يمكنها المساعدة في اكتشاف منشطات أو مثبطات البروتينات والمستقبلات الغشائية.

على الرغم من أن هذه الطريقة تبدو بسيطة، إلا أنه يجب توخي الحذر عند اختيار النسبة الصحيحة بين البروتين والدهون. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في حساب النسبة المولية الصحيحة أو في إجراء الضوابط المناسبة التي تضمن جودة التحضير. لذا، فإن العرض المرئي لهذه الطريقة مفيد جداً للطالب المبتدئ لتعلم الخطوات المختلفة والصعوبات المحتملة.

لبدء إنماء البروتين MSP المسمى بسداسي الهيستيدين (hexa histidine tagged) في سلالة e coli BL 21 DE3 من البلازميد P MSSP 1D1، يتم تحفيز إنتاج البروتين عندما تصل الكثافة الضوئية المقاسة عند 600 nanometers إلى حوالي 0.5 لمدة ثلاث ساعات عند 37 °C، ثم تُجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 ×g لمدة 10 دقائق عند 4 °C. يتم إعادة تعليق الراسب في محلول TSG 10 المنظم الذي يحتوي على 100 µM من PMSF، وتُحلل الخلايا باستخدام المكبس الفرنسي (French press) ثلاث مرات عند 8,000 PSI. تُزال المواد غير الذائبة عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 ×g لمدة 10 دقائق عند 4 °C. بعد ذلك، يتم عزل الجزء الذائب الذي يحتوي على MSP عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 125,000 ×g لمدة 45 دقيقة.

قم بتنقية البروتين MSP عن طريق كروماتوغرافيا مخلبية للنيكل باستخدام حوالي 1.5 ملليلتر من nickel seros عالية الأداء في منظم TSG 10. اغسل الشوائب باستخدام منظم TSG 10 الذي يحتوي على 50 ميلي مولار ILE، ثم استخلص البروتين MSP باستخدام منظم TSG 10 الذي يحتوي على 600 ميلي مولار I midaz بعد إجراء الديلزة.

يمكن تخزين البروتين المنقى في محلول منظم TSG 10 MSP عند درجة حرارة 70- درجة مئوية وبتركيز بروتيني يتراوح تقريبًا بين 10 إلى 15 mg/mL. يتم التعبير عن معقد MALF GK 2، والموسوم بـ his عند الطرف الكربوكسيلي (C terminus) لـ MAL K، من البلازميد PED 22 FG K المنمى في سلالة e coli BL 21 DE 3؛ حيث يتم تحفيز إنتاج البروتين عندما تصل الكثافة الضوئية المقاسة عند 600 nm إلى حوالي 0.5 باستخدام 0.2%L Arabs لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية، وذلك بعد تحلل الخلايا والطرد المركزي.

كما سبق، نقوم بتعليق كتلة الغشاء في منظم TSG 20 بتركيز نهائي قدره خمسة مليغرام لكل ملي لتر. بعد ذلك، يتم إذابة المادة باستخدام GDM بتركيز 1% وزن/حجم لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة أربع درجات مئوية مع الرج الخفيف. تزال المواد غير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي الفائق كما هو الحال في تنقية MAL FTK two.

بعد ذلك، يتم جمع الراشح الذي يحتوي على معقد mal FTK two المذاب وتنقيته مرة أخرى باستخدام كروماتوغرافيا مخلبية للنيكل. ثم يتم تنقية المعقد بشكل إضافي عن طريق كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي في منظم TSGD على عمود SUEx 200, HR ten three hundred بمعدل تدفق قدره 0.5 milliliters per minute. ولتحضير الفوسفوليبيدات، يتم تقسيم مستخلص دهني كلي من بكتيريا e coli مذاب في الكلوروفورم إلى حصص مقدارها 1000 anomal في أنابيب ميكروفيتش ذات غطاء لولبي، ثم يُبخر المذيب تحت تيار لطيف من النيتروجين ويُجفف بشكل إضافي طوال الليل في الفراغ.

قم بالتجفيف بعد ذلك، ثم أذب الغشاء الليبيدي في محلول TS المنظم بتركيز نهائي 5 NMO، ورج الخليط بقوة باستخدام جهاز Vortex، ثم استخدم جهاز سونيكات النبضات (pulse sonicate) خمس مرات لمدة خمس ثوانٍ تقريباً. ستظهر الليبيدات المذابة معتمة قليلاً بسبب عدم قابليتها العامة للذوبان في محلول TS المنظم المائي، ولكن يجب أن تظل عالقة في المعلق. أضف DDM ليصل التركيز النهائي إلى 0.5%، وعند هذه النقطة، سيصبح المحلول صافياً. ضع خليط الليبيدات في حمام مائي واستخدم جهاز سونيكات النبضات خمس مرات لمدة خمس ثوانٍ تقريباً.

يمكن تخزين خليط الدهون عند درجة حرارة 4 °C لمدة أقصاها أسبوع واحد. لتحضير حبيبات bio beads، ضع ما يقرب من 10 إلى 15 ml من حبيبات bio beads في أنبوب سعة 50 ml. أولاً، اغسل الحبيبات باستخدام 50 ml من الميثانول بتركيز 100%.

اترك الخرزات تترسب بفعل الجاذبية ثم اسكب المحلول برفق. كرر هذه العملية مرة واحدة باستخدام الميثانول، ثم مرتين لكل من الإيثانول 95% ومياه milli Q، وأخيراً باستخدام منظم TS. ابدأ تكوين nano discrete عن طريق تخفيف MSP في منظم TSGD للوصول إلى التركيز النهائي الذي يبلغ حوالي سبعة مليجرام لكل مليليمتر أو 0.3 ملي مولار.

لضمان نجاح التجربة، من المهم اختيار النسب الصحيحة للدهون والبروتينات التي سيتم خلطها معاً. اخلط ما يقارب 2 M من معقد malf GK two المنقى بنسبة بروتين إلى MS P إلى دهون تبلغ 1:3:60 في محلول TSGD المنظم لتحصل على حجم نهائي قدره 300 µL. هنا، يتم أيضاً تحضير عينة من الدهون الزائدة بنسبة 1:3:400 كعينة ضابطة سالبة. أضف 50 µL من معلق bio bead إلى الأنبوب واترك الخليط يحضن طوال الليل على طاولة هزازة عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، يتم ترسيب الحبيبات بفعل الجاذبية. وبمجرد استقرار الحبيبات، اسحب المحلول باستخدام طرف ماصة ضيق لتجنب سحب أكبر قدر ممكن من bio beads.

قم بإزالة الرواسب الكبيرة عن طريق الطرد المركزي الفائق بسرعة 100, 000 GS لمدة 20 دقيقة. انتقل بعد ذلك إلى تنقية الأقراص باستخدام كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي كما تم تنفيذها سابقاً في محلول TSG 10 المنظم. بعد ذلك، احقن Eloqua في عمود الترشيح الهلامي نفسه لاختبار استقرار التحضير.

بعد ذلك، يتم تجميع الأجزاء التي تحتوي على الأقراص. وتُقيم جودة التحضير بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي. قم بتحليل تركيز واحد ميكرومولار من الأقراص النانوية لتقييم جودة إعادة التشكيل.

قم أيضاً بتقييم ارتباط mal E بمعقد mal ftk two المعاد تشكيله في أقراص نانوية. بعد الرحلان الكهربائي، صبغ الهلام بصبغة كوماسي بلو لمدة 10 دقائق ثم إزالة الصبغة الزائدة لمدة ساعة واحدة تقريباً. لإجراء تشتت الضوء الديناميكي أو DLS، قم أولاً بتنقية الأقراص النانوية بواسطة كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي كما سبق، باستخدام عمود SUEx 200 HR ten three hundred بمعدل تدفق 0.1 milliliters per minute.

جمّع الكسور التي تحتوي على الأقراص النانوية، وقم بتركيزها لتصل إلى ١٠ milligrams per milliliter تقريبًا باستخدام مرشح طرد مركزي AmCon. ثم قم بترشيح العينة مرتين. أجرِ التحليل عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS) باستخدام جهاز dynapro nano star في خلية كوارتز ذات حجم داخلي يبلغ one microliter.

باستخدام البرمجيات الديناميكية لتقدير قطر الجسيمات ووزنها الجزيئي، حدد نشاط ATPases لـ nano discs المعاد تكوينها من mal FTK two باستخدام مقايسة chole metric. أولاً، اخلط 1 µM من الأقراص المنقاة و1 mM من ATP مع كميات متزايدة من mal e. حضّن العينات عند 37 °C لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، قم بقياس تحرر الفوسفات غير العضوي عند 660 نانومتر. قارن كمية الفوسفات المتحررة بمنحنى قياسي تم إنشاؤه باستخدام محلول فوسفور قياسي. يتم تنقية الأقراص النانوية عن طريق كروماتوغرافيا الترشيح الهلامي.

يظهر الكروماتوغرام أن غالبية الأقراص المعاد تشكيلها تشطف كقمة واحدة، بينما تشطف الأقراص المصنوعة من ليبيدات زائدة في الحجم الميت، وعلى شكل سلسلة من القمم العريضة؛ كما يتم تحليل جودة تحضير الأقراص بشكل إضافي عن طريق الفصل الكهربائي للهلام الأصلي (native gel electrophoresis)، حيث تهاجر الأقراص المعاد تشكيلها بكمية محدودة من الليبيدات كحزمة حادة على الهلام الأصلي، بينما تهاجر تلك التي أعيد تشكيلها في وجود كمية زائدة من الليبيدات على شكل لطخات. ويظهر تحليل تشتت الضوء الديناميكي (DLS) أن مجموعة الأقراص متجانسة بمتوسط نصف قطر يبلغ 5.0 nanometers. وبناءً على تقدير DLS، فإن للأقراص المعاد تشكيلها وزن جزيئي ظاهري يبلغ 215 kilodaltons، بينما تظهر العينات المعاد تشكيلها في وجود ليبيدات زائدة أنصاف أقطار موزعة على نطاق واسع حول 100 nanometers، وهو أمر نموذجي للعينات غير المتجانسة.

يتم تقييم نشاط معقد MAL FTK two عن طريق قياس معدل تحلل TP والألفة تجاه الشركاء المتفاعلين مثل بروتين ربط المالتوز، MAL E. يرتبط MAL E بألفة عالية مع ناقل MAL FTK two باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام غير المسخ. ومن الممكن الكشف عن معقد بين MAL E و MAL ftk two، ويظهر هنا تحفيز نشاط MAL KA TPA بواسطة MAL E كدالة في تركيز MAL e.

تعد عملية تحضير الأقراص النانوية بسيطة نسبياً، ومع ذلك، فإن الانحرافات الطفيفة عن الظروف المثالية قد تؤدي إلى تجمع بروتيني غير عكسي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في أقل من يومين. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أهمية اختيار نسبة البروتين إلى الدهون الصحيحة، لأن الكمية الزائدة من الدهون ستؤدي إلى إنتاج جزيئات شبيهة بالليبوسومات كبيرة ومتعددة التشتت. ومن الضروري جداً تحليل جودة المادة المعاد تشكيلها بعناية باستخدام تقنيات أخرى غير الترشيح الهلامي، مثل مطيافية تشتت الضوء، أو الطرد المركزي الفائق التحليلي، أو ببساطة الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي.

تذكر أن نوع الفوسفوليبيد المدمج في القرص، وكذلك نوع بروتين السقالة الغشائية، يمكن أن يساهم في كفاءة عملية إعادة التشكيل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، نأمل أن تكون قد اكتسبت فهماً جيداً لكيفية إنتاج أقراص نانوية ذائبة ومتجانسة تحتوي على بروتين الغشاء الذي اخترته. حظاً موفقاً في تجاربك.