أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans
أكتوبر 14, 2021
يصف البروتوكول التالي تطوير وتحسين سير عمل عالي الإنتاجية لزراعة الديدان والتصوير الفلوري ومعالجة الصور الآلية لتحديد كمام البولي جلوتامين كميا كتقييم للتغيرات في البروتيوستاسيس.
تم اتباع نهج بسيط لرصد التغيرات في البروتيوستاسيس من خلال تقييم تجميع البولي جلوتامين وتوفير إطار يمكن استخدامه للتطبيقات عالية الإنتاجية. يمكن أن يصبح تسجيل النمط الظاهري مثل عدد المجاميع بواسطة I ذاتيا. تتيح لنا أتمتة العد الكلي القضاء على هذا التحيز وزيادة الإنتاجية والتكرار.
تساعد هذه الطريقة على تحديد الجينات البكتيرية التي تساهم في اضطراب البروتينات المضيفة. سيساعدنا فهم مساهمة الجينات البكتيرية الفردية على فهم آثارها في التسبب في أمراض مثل الزهايمر وباركنسون وهانتنغتون. ابدأ بإزالة الألواح التي تحتوي على الديدان من الفريزر وتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة.
ثم امسح التكثيف الزائد وأزل الغطاء قبل التصوير. استخدم إعدادات المجهر مع وقت التعرض 500 مللي ثانية ، والتكبير 40 × مع محول الكاميرا 0.63 × ، وضبط كثافة GFP على 100٪ أثناء التقاط الصورة. الآن اضبط عناصر التحكم في الضوء المنقول حتى تظهر الديدان مضاءة بشكل ساطع مقارنة بالخلفية المظلمة ، وتجنب التعرض المفرط.
قم بتغيير مواضع الديدان داخل البئر لمنع التكتل المفرط باستخدام طرف ماصة 10 ميكرولتر لدفع الديدان بلطف إلى الموضع المطلوب. اضبط القناة على مرشح GFP لإنشاء مستوى بؤري لكلتا الصورتين. التقط صورة ميدانية ساطعة.
التقط صورة فلورية مقابلة دون إزعاج اللوحة أو تغيير تركيز المجهر. الآن لتقييم الصور ، قم أولا بتنزيل CellProfiler. افتح البرنامج ، واسحب الصور ذات الأهمية وأفلتها في مربع الصور.
انقر على الصور في قائمة الملفات لفتحها. حدد زجاج المكبر لتمييز منطقة ذات أهمية ورمز السهم لقياس طول كل من الديدان والمجاميع. مرر مؤشر الماوس فوق الكائن المطلوب لتحديد قيمة كثافته، والتي يمكن رؤيتها في الجزء السفلي من الشاشة.
للاستفادة من خط أنابيب تحليل الصور CellProfiler ، قم بتسمية أزواج الصور بشكل صحيح كما هو موضح في مخطوطة النص بعد تنزيل CellProfiler من الموقع الرسمي. قم بتنزيل خط الأنابيب وتحميله إلى CellProfiler عن طريق تحديد الملف والاستيراد وخط الأنابيب من الملف. حدد وحدة الديدان غير المتشابكة لفتح إعداداتها لتحميل مجموعة تدريب تستخدم لتحديد الديدان في وحدة الديدان غير المتشابكة.
ثم حدد اسم ملف مجموعة التدريب. حدد رمز تحميل الملف وقم بتحميل الملف التكميلي أيضا. قم بتحميل الصور عن طريق تحديد وحدة الصور في الزاوية العلوية اليسرى.
ثم قم بسحب وإسقاط الصور المسماة بشكل صحيح. قبل تحليل الصور ، حدد مجلد الإخراج المطلوب الذي سيتم استخدامه لتخزين النتائج بالنقر فوق زر إعدادات الإخراج الموجود بالقرب من الزاوية السفلية اليسرى من البرنامج. ثم حدد رمز المجلد على يمين الإخراج الافتراضي لاختيار موقع الإخراج المطلوب.
حدد أيقونة تحليل الصور لبدء تحليل الصور. إذا استغرق التحليل وقتا طويلا لإكماله وتوقف في معالجة صورة واحدة ، فقم بإجهاض التشغيل وتحديد الصورة غير المعالجة عن طريق الفرز من خلال مجلد الإخراج ، وملاحظة اسم الصورة الذي لم يتم العثور عليه. بعد التحليل الكامل ، سيقوم البرنامج بتنظيم النتائج في جدول بيانات Excel يحتوي على ديدان فردية في العمود N ، وعدد المجاميع المعنية في العمود K.Download منظم بيانات التعريف لتنظيم البيانات بسهولة من ملف CSV الناتج من CellProfiler.
بالنسبة لنظام التشغيل Windows ، حدد موقع الملف الذي تم تنزيله واستخراجه إلى الموقع المطلوب. حدد موقع المجلد المستخرج المسمى gui_Windowsos_64x وافتحه. وقم بتشغيل التطبيق من خلال النقر على أيقونة تطبيق واجهة المستخدم الرسومية.
قد يتم فتح مطالبة تطلب إذنا بالتشغيل. حدد المزيد من المعلومات ثم انقر فوق تشغيل على أي حال. منظم بيانات التعريف جاهز الآن لسحب وإسقاط ملفات CSV الناتجة عن CellProfiler.
بالنسبة لنظام التشغيل Mac OS، حدد موقع الملف الذي تم تنزيله واستخرج ملف تطبيق منظم البيانات الوصفية للملف. افتح المجلد المستخرج الموجود في التنزيلات. انقر بزر الماوس الأيمن على تطبيق واجهة المستخدم الرسومية وحدد فتح.
ستظهر مطالبة تطلب الإذن بالفتح بسبب عدم وجود ترخيص رسمي. حدد فتح. بمجرد فتح تطبيق منظم البيانات الوصفية الخاص بك في نظام التشغيل المعني ، انقر فوق تحميل ملفاتك هنا ، أو اسحب وأفلت ملفات CellProfiler CSV المطلوبة.
انقر فوق الزر "تنظيم" ، والذي سيجلب المستخدم إلى شاشة جديدة باستخدام زر تنزيل الملفات. انقر فوق الزر وحدد الموقع المطلوب لحفظ ملف الإخراج. سيظهر ملف الإخراج كاسم الملف الأصلي مع إضافة ملحق _organized إلى اسم الملف.
في وجود FODR ، كان للديدان التي تم تغذيتها ببكتيريا مختلفة حجم جسم أكثر اتساقا مما سمح باكتشاف أكثر اتساقا ودقة للديدان ، وبالتالي حل مشكلة الاكتظاظ. أدى تجميد الديدان إلى تحسين اكتشاف الركام polyQ من خلال القضاء على التألق في الخلفية ، بالإضافة إلى دقة العد الآلي مقارنة بالعد اليدوي. تم استخدام إضاءة الحقل الساطع المقلوبة للكشف عن قناة C.elegans و GFP بأكملها لتصوير مجاميع polyQ YFP.
تم الكشف عن الدودة وفك تشابكها وتكميمها المجمعة لكل دودة من خلال تطبيق خط أنابيب محسن لمعالجة صور CellProfiler ، والذي يسمح بالحصول على عدد المجاميع لكل دودة فردية. كان الفرق بين فعالية القياس الكمي الكلي الآلي واستخدام خط أنابيب CellProfiler ضئيلا ، مما يشير إلى أنه يمكن تطبيق الطريقة الآلية على شاشات واسعة النطاق. من بين 90 سلالة بكتيرية تم اختبارها ، أظهر استعمار أمعاء C.elegans مع مرشح واحد انخفاضا كبيرا في عدد المجاميع.
كشفت تجارب التأكيد عن طريق العد اليدوي أن أيا من الطفرات ، بما في ذلك تلك التي خفضت بشكل كبير عدد المجاميع أثرت على تجميع polyQ. يجب على الباحثين الذين يقررون استخدام هذا الإطار أن يفهموا أن الخطوات الموضحة ليست مطلقة. يعد التعديل والفهم الأساسي لكيفية التعامل مع CellProfiler ضروريين للنجاح.
يمكن استخدام مناهج كيميائية حيوية إضافية مثل النشاف الغربي لتأكيد تجميع polyQ.
نظرة عامة
تطور هذه الدراسة سير عمل عالي الإنتاجية لاستزراع الديدان، والتصوير الفلوري، والمعالجة الآلية للصور لتقدير تجمعات polyglutamine كمقياس للتغيرات في التوازن البروتيني (proteostasis). تعزز هذه الطريقة من تقييم هذه التجمعات، لا سيما في استكشاف دورها في الأمراض التنكسية العصبية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال البحث
- التوازن البروتيني
- الأمراض التنكسية العصبية
- الفحص عالي الإنتاجية
خلفية علمية
- يرتبط تجمع البولي جلوتامين بأمراض مثل ألزهايمر وباركنسون وهانتنغتون.
- يعد فهم مساهمات الجينات البكتيرية في اختلال التوازن البروتيني أمراً ضرورياً.
- يمكن أن تكون طرق التقييم التقليدية للتجمعات ذاتية التقدير.
الطرق المستخدمة
- التصوير والتحليل عالي الإنتاجية باستخدام CellProfiler
- استخدام C. elegans كنموذج بيولوجي
- التقدير الكمي الآلي لتجمعات البولي جلوتامين
النتائج الرئيسية
- تسمح المعالجة الآلية للصور بالقضاء على التحيز وزيادة إمكانية تكرار النتائج في عد التجمعات.
- تحديد الجينات البكتيرية التي تؤثر على التوازن البروتيني (proteostasis) للمضيف، مع وجود نتائج جوهرية في أعداد تجمعات الديدان.
- تشير النتائج التي تم التحقق من صحتها إلى أن الأتمتة تعادل العد اليدوي، مما يدعم إجراء عمليات الفحص واسعة النطاق.
الاستنتاجات
- توفر هذه الدراسة إطاراً موثوقاً لدراسة التوازن البروتيني (proteostasis) من خلال تجميع البولي جلوتامين.
- تعد الرؤى المكتسبة من هذه الطريقة ذات صلة بفهم الآليات المسببة للأمراض التنكسية العصبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تؤدي أتمتة تقدير كمية التجمعات في ديدان *C. elegans* إلى تلبية الحاجة لإجراء تقييم عالي الإنتاجية وغير متحيز للتوازن البروتيني في نماذج الأمراض التنكسية العصبية. ومن خلال توحيد عملية الحصول على الصور والتحليل القائم على برنامج CellProfiler، تتيح هذه الطريقة إجراء فحص قابل للتكرار لمكتبات كبيرة من المركبات أو المكتبات الجينية. ويدعم ذلك التحقق المبكر من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في مسارات الاكتشاف الخاصة بأمراض التشكل البروتيني.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس تجمع polyglutamine كدليل على اختلال التوازن البروتيني (proteostasis).
- القيمة التشغيلية: يقلل من الذاتية في تقييم الأنماط الظاهرية، مما يحسن موثوقية البيانات في حملات التحقق من الأهداف.
- القيمة التنبؤية: يدعم فرز المحافظ الدوائية من خلال توفير قراءات كمية وقابلة للتكرار لتحديد أولويات المركبات بناءً على الآلية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج أعداداً تجميعية كمية وموحدة لكل دودة، مما يتيح قراءات دقيقة للمقايسات من أجل حملات الفحص.
- القيمة التشغيلية: يزيد من الإنتاجية وقابلية التكرار من خلال الأتمتة، مما يقلل من العمل اليدوي والتباين بين المشغلين.
- جاهزية المقايسة: يُنتج مخرجات منظمة (جدول بيانات Excel يتضمن أعداد الديدان والتجمعات) متوافقة مع سير عمل تحليل البيانات اللاحق.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يربط نماذج التوازن البروتيني في *C. elegans* بآليات الأمراض التنكسية العصبية البشرية عبر مسارات تجمع polyQ المحفوظة.
- تقليل المخاطر الآلية: يسهل تحديد المعدلات البكتيرية أو الجينية للتجمع، مما يدعم التحقق من الأهداف في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
- الثقة التنبؤية: يُمكّن الفرق متعددة الوظائف من مقارنة الظروف باستخدام قياس كمي مؤتمت ومعير للتجمعات.
تكامل تدفق العمل ومسارات المعالجة
تتناسب هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر قراءات كمية للتوازن البروتيني (proteostasis) تساهم في اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بآليات التوازن البروتيني (proteostasis) من خلال تمكين التنميط الظاهري للتكدس عالي المحتوى والموضوعي.
- الفحص: يوفر تصويراً وتحليلاً معيارياً للديدان جاهزاً للمقايسة ومتوافقاً مع عمليات الفحص في أطباق ذات 96 بئراً أو تنسيقات أكبر.
- التحليلات: ينتج قياسات كمية للمتغير التابع (التكدسات لكل دودة) تسمح بإجراء مقارنة إحصائية عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط نتائج نماذج اللافقاريات بمسارات الأمراض البشرية من خلال بيولوجيا التكدس المحفوظة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لمسار تصوير وتحليل قابل لإعادة الاستخدام وقابل للتكيف مع أهداف متعددة للتوازن البروتيني وحملات فحص متنوعة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال القضاء على الانحياز الناتج عن العد اليدوي للتجمعات.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية التكرار والقابلية للتوسع من خلال معالجة الصور الموحدة ومخرجات البيانات المؤتمتة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين عمليات الفحص واسعة النطاق مع تقليل الوقت اليدوي المستغرق ورفع جودة البيانات.
- التأثير على المحفظة: تدعم قرارات التطوير المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال مؤشرات حيوية كمية وموثوقة للتوازن البروتيني (proteostasis).
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب الإلمام بالمجهر الفلوري ومعايير تصوير GFP/YFP للكشف عن polyQ.
- يعتمد على برنامج CellProfiler وتكوين مسار العمل المرتبط به للتجزئة الآلية للديدان والتجمعات.
- يستلزم توحيد تسمية الصور وتنظيم المجلدات لضمان نجاح المعالجة المجمعة.
- يستفيد من المعالجة بـ FUDR لتقليل التباين في حجم الديدان وتحسين دقة الكشف في الآبار عالية الكثافة.
- يعتمد على تدريب المستخدم لتكييف مسار العمل مع سلالات الديدان المختلفة، أو أنماط التعبير، أو إعدادات التصوير.
