انعكاس التداخل المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصوير الأنابيب الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بها

تكمن أهمية هذه الطريقة في أنها تسمح بالأنابيب الدقيقة الخالية من الملصقات إلى الصورة في وقت واحد مع البروتينات ذات العلامات الفلورية بمعدلات إطارات عالية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي سهولة تنفيذها والحد الأدنى من الطلبات على المكونات البصرية. كما أنه يتحايل على الحاجة إلى وضع العلامات على الفلورو-4 للأنابيب الدقيقة.

للبدء ، قم بإعداد بوليمر PDMS من خلال الجمع بين عامل المعالجة والمطاط الصناعي الأساسي بنسبة كتلة 1: 10. اخلطيها لمدة دقيقتين ثم قم بفك الخليط في غرفة فراغ حتى تختفي جميع الفقاعات. بعد ذلك ، صب الخليط على القالب الرئيسي في طبقة بسمك 0.5 سم تقريبا ، مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات ، واخبز الخليط في فرن مسخن مسبقا عند 70 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.

ثم ، قم بقطع المناطق الهيكلية للبوليمر وثقوب الثقب في كل طرف من أطراف القناة باستخدام مثقاب PDMS. في وقت لاحق ، قم بتنظيف الجانب المنظم من كتلة PDMS. بعد ذلك ، شطف ثلاث مرات مع الأيزوبروبانول والميثانول تليها المياه فائقة النقاء وتجفيف السطح.

بعد ذلك ، تقوم البلازما بتنظيف PDMS باستخدام الأكسجين أو بلازما الهواء ووضع PDMS الذي تم تنظيفه بواسطة البلازما على زجاج غطاء تم تنظيفه بشكل مناسب. سخني صفيحة ساخنة على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أدخل أنابيب البولي إيثيلين منخفضة الكثافة ذات الحجم المناسب في الثقوب وقم بتوصيل أنبوب المخرج بحقنة سعة 0.5 ملليلتر.

ثم ، قم بتدفق المحاليل إلى القنوات الدقيقة عن طريق غمر أنبوب المدخل في المحلول ورسم الحجم المطلوب باستخدام المحقنة. ضع العينة على مرحلة المجهر وقم بتشغيل مصدر ضوء الإضاءة epi-litation لتصوير IRM. لتركيز المجهر، ابحث عن المستوى البؤري الصحيح بالقرب من واجهة حل PDMS واختر مجال رؤية بالقرب من مركز القناة.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول 0.1-micromolar من الميكروبيدات الفلورية في BRB80 والتدفق في حجم قناة واحدة على الأقل من محلول الميكروبيد. راقب التفاعل عبر IRM أو TIRF. عندما يتم تحقيق الكثافة المطلوبة من الميكروبيدات ، اغسل الفائض باستخدام BRB80.

تدفق البذور المخففة إلى غرفة التفاعل ومراقبة التفاعل من خلال IRM. عندما يتم تحقيق الكثافة المطلوبة من البذور ، اغسل الفائض باستخدام BRB80. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط تمديد microtubule يحتوي على 12-micromolar tubulin غير المسمى ، GTP واحد ملليمولار ، DTT خمسة ملليمولار في المخزن المؤقت BRB80.

ثم ، تدفق في حجم قناة واحدة على الأقل من خليط التمديد مع ضمان أن درجة حرارة التفاعل هي 28 درجة مئوية. للبدء، قم بتعيين إعدادات التصوير على برنامج المجهر. بدء التصوير وتدفق محلول كينيسين إلى الغرفة.

ثم ، تصور GFP المسمى kinesin 1 الأنابيب الدقيقة غير المتقلصة. بعد اكتمال القياس ، سجل مقطع فيديو قصيرا يتم فيه ترجمة المرحلة ببطء في حركة دائرية أو جانبية. سيكون متوسط الإسقاط لهذا الفيديو بمثابة صورة خلفية وسيتم طرحه من القياسات الأولية.

قم بإنشاء إسقاط متوسط في ImageJ من تسجيل الخلفية بالنقر فوق صورة. ثم حدد الخيار مكدسات وانقر على Z Project. بعد ذلك ، اطرح متوسط إسقاط الخلفية من بيانات الصورة الخام بالنقر فوق عملية ثم حدد الخيار حاسبة الصور مع التأكد من التحقق من خيار نتيجة التعويم 32 بت.

لتسجيل الصور ، اختر مجموعة من الميكروبيدات بالقرب من الأنابيب الدقيقة ذات الأهمية واستخدمها لمحاذاة صور TIRF و IRM. لكل حبة في هذه المجموعة، استخدم أداة التحديد متعدد النقاط لتحديد الموقع التقريبي في قناة TIRF ثم الموقع المقابل في قناة IRM. ثم قم بتشغيل الماكرو ImageJ المتوفر.

تظهر الميكروبيدات كبقع داكنة في قناة IRM على اليمين وكنقاط مضيئة في قناة TIRF على اليسار. يقوم إجراء المحاذاة بتراكب القناتين بشكل صحيح عن طريق توطين مجموعة مختارة من الخرز. كما تم الحصول على كيموجغراف لجزيئات كينيسين المسماة EGFP التي تسير نحو الأطراف المتقلصة للأنابيب الدقيقة باستخدام هذا البروتوكول.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم اختيار أهداف فتحة العددية العالية من أجل تحقيق انعكاس داخلي كامل وأيضا لزيادة كفاءة المجموعة وتباين الصورة إلى أقصى حد. يمكن استخدام هذه الطريقة للتصوير عالي الدقة لجزيئات الفلورسنت المفردة في وقت واحد داخل البنية الجزيئية الكبيرة الضخمة بما يكفي لتصورها بواسطة IRM ، مثل غشاء الخلية أو خيوط الأكتين. يوفر هذا البروتوكول أيضا إجراء قابلا للتكيف بسهولة للتصوير المتزامن مع أي مزيج من IRM و TIRF و epifluorescence.