قياس انضغاط الخلية والنواة على أساس المجهر الصوتي

تلعب ميكانيكا الخلايا دورا مهما في ورم خبيث في ورم خبيث للخلايا والحساسية الإشعاعية. يمكن لطريقة الموائع الصوتية تحقيق قياس سريع وغير مدمر في الحالات المعلقة. يمكن استخدام هذه التقنية لعكس تغير الانضغاط الذاتي أثناء الانتقال الظهاري إلى الوسيط وفصل الخلايا السرطانية المنتشرة ، مما يدل على آفاق تطبيقها في تشخيص السرطان.

للبدء ، قم بربط كتلة PDMS بالشريحة عن طريق ثقب الثقوب في كتلة PDMS لمنافذ المدخل والمخرج بإبرة مجوفة قطرها ملليمتر واحد. ثم ضع كتل PDMS ورقاقة مع الجانب الخلفي في منظف البلازما لمدة دقيقة واحدة. بعد محاذاة الثقوب الموجودة على كتل PDMS مع مدخل الشريحة ومخرجها ، اضغط برفق على كتل PDMS على الشريحة لمدة 15 ثانية ، مما يؤدي إلى حدوث ترابط بين كتل PDMS وسطح الشريحة.

لتوصيل قسطرة PTFE بالرقاقة ، اقطع قطعتين من القسطرة بقطر داخلي يبلغ 0.8 ملم وطول 10 سم. ثني إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر داخلي يبلغ 0.7 ملليمتر وطول 1.5 سم × 90 درجة في شكل L وتوصيلها بأحد طرفي القسطرة. أدخل إبر الفولاذ المقاوم للصدأ في ثقوب كتل PDMS.

بالنسبة للمدخل، قم بتوصيل إبرة توزيع مقياس 19 بالطرف الآخر من القسطرة كموصل لمحقنة. بعد ذلك ، حقن الماء منزوع الأيونات لاختبار ضيق القناة الكلية. للحصول على مجموعة سيراميك كهرضغطية ، حدد صفائح السيراميك الكهرضغطية المقطوعة مسبقا بعرض خمسة ملليمترات.

ثم أسلاك اللحام على جانبي السيراميك الكهرضغطي في نهاية واحدة. قم بلصق السيراميك الكهرضغطي في منتصف الجزء الخلفي من الشريحة عن طريق وضع قطرة من غراء سيانو أكريليت على السيراميك الكهرضغطي. قم بتنعيم الغراء باستخدام المسواك وإزالة الغراء الزائد.

ثم اضغط عليه بسرعة على الشريحة واستمر في الضغط لمدة دقيقة واحدة تقريبا. لتركيب الجهاز الصغير ، قم بقص قطعة من PDMS كقاعدة للجهاز الصغير ولصق جانب واحد من القاعدة بكتل PDMS للمدخل والمخرج والجانب الآخر بشريحة زجاجية شفافة باستخدام شريط على الوجهين. قم بإصلاح الجهاز الصغير بأكمله في مرحلة المجهر للحفاظ على الشريحة في مستوى بؤري واحد.

لإعداد حلول جسيمات البوليسترين القياسية ، أضف 0.05 ملليلتر من محلول جسيمات البوليسترين إلى 10 ملليلتر من PBS واخلطها جيدا. ثم قم بإعداد معلقات الخلايا عن طريق غسل الخلايا الملتصقة عند التقاء 90٪ مع PBS. أضف 500 ميكرولتر من 0.25 التربسين لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد إزالة التربسين ، أضف ملليلتر واحد كامل الوسط وشكل تعليق خلية عن طريق السحب. التالي الطرد المركزي تعليق الخلية في 100 G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة supernatant وإعادة التعليق في 0.5 إلى ملليلتر واحد من PBS من أجل الحصول على تعليق الخلية.

ثم تم حساب الخلايا باستخدام مقياس الدم وكان التركيز حوالي 300 إلى 500،000 خلية لكل ملليلتر. بعد تحضير تعليق نواة الخلية كما هو موضح سابقا ، قم بإزالة supernatant وإضافة 200 ميكرولتر من كاشف استخراج البروتين السيتوبلازمي A لكل 20 ميكرولتر لوحة خلية وتخلط جيدا. ثم دوامة الخليط أعلاه في 220 غرام لمدة خمس ثوان ووضعها على حمام الجليد لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من كاشف استخراج البروتين السيتوبلازمي B إلى المحلول بعد الحضانة. بعد الدوامة ، ضعه على حمام جليدي لمدة دقيقة واحدة ودوامة مرة أخرى عند 220 جم لمدة خمس ثوان. ثم ، أخيرا ، جهاز طرد مركزي في 1000 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

قم بإزالة supernatant وأعد تعليق اللوحة في ملليلتر واحد من PBS. ثم جهاز طرد مركزي عند 1000 غرام عند أربع درجات مئوية لمدة أربع دقائق. بعد إزالة supernatant ، أعد التعليق في 100 ميكرولتر من PBS كتعليق نواة الخلية.

أضف التربان الأزرق إلى تعليق نواة الخلية أعلاه ووصمة عار في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. بعد ذلك ، احسب عدد النوى تحت المجهر المقلوب بهدف 10x. قم بتخفيف تعليق نواة الخلية أعلاه باستخدام مخزن PBS المؤقت إلى تركيز 200 إلى 300،000 نواة لكل ملليلتر.

ثم قم بتصفية تعليق نواة الخلية من خلال غربال 70 ميكرومتر. لإعداد نظام القياس، قم بتشغيل مصدر ضوء المجهر وافتح برنامج الكاميرا. استخدم هدف 4x للعثور على الموضع الأوسط للقناة الدقيقة ، أي موضع السيراميك الكهرضغطي.

بعد توصيل الأسلاك ، قم بلحامها بالمحطات الموجبة والسلبية لإخراج مولد الإشارة للسيراميك الكهرضغطي على التوالي. ثم ضع المحقنة على مضخة الحقن المجهري وقم بتوصيلها بقسطرة المدخل. لجمع السائل من القناة الدقيقة ، ضع حاوية صغيرة في نهاية قسطرة المخرج.

لتحديد معلمات القياس ، استنشق محلول جسيمات البوليسترين باستخدام المحقنة. ثم قم بحقن المحلول في القناة الدقيقة للرقاقة مع تجنب فقاعات الهواء وفي القناة الدقيقة للرقاقة لضمان القياس الدقيق. اضبط خرج مولد الإشارة على إشارة إشارة بتردد واحد ميغاهرتز وجهد من الذروة إلى الذروة يبلغ 10 فولت حتى يلاحظ أن الجسيمات تتحرك نحو خط الوسط للقناة الدقيقة وتظل في حركة أمامية على طول خط الوسط بعد الوصول إلى خط الوسط.

بعد خلط خلية ملليلتر واحدة أو تعليق النواة مع محلول الجسيمات القياسي بنسبة واحد إلى واحد ، حقنه في القناة الدقيقة باستخدام حقنة لقياس الخلايا والنواة. ابدأ التسجيل باستخدام كاميرا CCD عندما تدخل الخلايا أو النوى مجال الرؤية وتشغيل مولد الإشارة. ثم شطف القناة الدقيقة بالماء منزوع الأيونات ، والكحول بنسبة 75٪ ، والماء منزوع الأيونات بالتسلسل للاستخدام لاحقا.

لوحظت حركة الخلايا والجسيمات تحت تأثير قوة المجال الصوتي نحو خط الوسط للقناة الدقيقة على فترات زمنية مختلفة. تم إجراء حساب الطاقة والكثافة وقابلية انضغاط الخلايا وتم الحصول على كثافة الطاقة الصوتية ومسار الحركة المقاسة للجسيم من أفضل نتيجة مناسبة. تم عزل النوى عالية النقاء والسليمة من الخلايا وتم تحقيق قياس انضغاط النواة من خلال الحصول على مسار حركة النواة.

تم قياس ومقارنة انضغاط أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية والخلايا بعد EMT الناجم عن الدواء أو تشعيع الأشعة السينية بجرعات مختلفة. تم جمع الخلايا المقاسة ووجد أنه لا يوجد فرق كبير في تكاثر الخلايا وقابليتها للحياة مقارنة بالمجموعة غير المعالجة بعد 48 ساعة من الزرع. مشيرا إلى أن قياس الانضغاط ليس له أي تأثير على تكاثر الخلايا وبقائها.

الشيء الأكثر أهمية هو ضبط تردد الإشارة حتى يلاحظ أن الجسيمات تتحرك نحو خط الوسط للقناة الدقيقة.