يتم تسهيل الكشف عن الهدف القائم على Aptamer بواسطة تفاعل تضخيم أسي متساوي الحرارة G-quadruplex من 3 مراحل
أكتوبر 6, 2022
يوضح البروتوكول الحالي استخدام مقايسة تضخيم أسي سريعة من 3 مراحل قائمة على aptamer للكشف عن الأهداف. يتم تغطية تحضير العينة وتضخيم الإشارة وتطوير اللون لتنفيذ هذا النظام للتعرف على وجود الثيوفيلين على الكافيين.
توفر هذه الطريقة طريقة لتضخيم الإشارة من أحداث الربط إلى شكل يمكن اكتشافه بصريا للاستخدام المنخفض للموارد أو يمكن قياسه كميا باستخدام الأجهزة القائمة على الامتصاص. هذا بروتوكول سريع نسبيا من وعاء واحد لتحديد وجود هدف aptamer في عينة من الاهتمام. يمكن مقارنة النتائج بمنحنى معايرة قياسي إذا كان القياس الكمي مطلوبا.
يجب أن يكون الأفراد دقيقين للغاية عند نقل الحلول وخلطها ، لأن الخلط غير الكافي سيؤدي إلى نتائج سلبية. تأكد أيضا من الحفاظ على تبريد الكواشف والمحاليل حتى استخدامها لتقليل إشارة الخلفية. ابدأ بتنشيط منتجات انقسام الريبوزيم بإضافة خمس وحدات من كيناز متعدد النوكليوتيد T4 في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل.
ثم أضف ميكرولترا واحدا من محلول الريبوزيم 5X المعد مسبقا إلى كل أنبوب عينة. لإثبات الخصوصية بصريا ، أضف 1.5 ميكرولتر من الثيوفيلين الملي أو اثنين من الكافيين المليمولي إلى كل أنبوب عينة كعينات اختبار واخلط كل عينة جيدا عن طريق سحب خمس إلى 10 مرات. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر من 600 من الحمض النووي الريبي النانوي يحتوي على مجال أبتاميري محدد الهدف لكل أنبوب عينة ، متبوعا بسحب لخلط المكونات بسرعة.
الآن ، ضع الأنبوب على كتلة باردة لتقليل إشارة الخلفية. بعد تحضير جميع أنابيب التفاعل ، احتضان كل عينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق بالضبط. في نهاية الحضانة ، أعد أنابيب العينة إلى الجليد على الفور.
أضف 3.5 ميكرولتر من خليط إنزيم نيكيس بوليميراز إلى كل أنبوب عينة واخلطه جيدا. بعد ذلك ، أضف 31.5 ميكرولترا من خليط تفاعل EXPAR الذي يحتوي على نيوكليوتيدات نموذجية ومخزن مؤقت للتفاعل إلى كل أنبوب عينة واخلطه عن طريق الماصة. بمجرد تحضير جميع العينات ، احتضن العينة المحضرة على حرارة 55 درجة مئوية لمدة خمس دقائق باستخدام جهاز توقيت.
أعد أنابيب العينة على الفور إلى الجليد بعد الحضانة. أضف 2 ميكرولتر من محلول الهيمين إلى كل أنبوب عينة لتطوير اللون واخلطه جيدا. بعد ذلك ، أضف 58 ميكرولترا من محلول TMB المتاح تجاريا إلى كل أنبوب عينة ، واخلطه جيدا ، واحتضنه لتطوير اللون.
اقرأ العينات نوعيا بالعين أو حدد النتائج باستخدام قارئ لوحة الامتصاص ، كما هو موضح في المخطوطة. يمكن للبنية المحسنة التعرف على أقل من 500 ثيوفيلين نانومولار في 30 دقيقة. تنتج مستحضرات العينات المعرضة للهدف لونا أزرق ، بينما تظل العينات التي لا تحتوي على هدف عديمة اللون.
تم إعداد منحنى قياسي من الإشارة المقاسة عند A450 بعد 30 دقيقة من تطوير اللون. من المهم الاحتفاظ بالعينات على الجليد عند عدم إجراء عمليات الحضانة ، حيث سيظل حتى الحمض النووي الريبي المحسن يظهر مستوى نشاط منخفض في الخلفية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول مقايسة تضخيم أسي سريعة تعتمد على الأبتامر وتتكون من 3 مراحل للكشف عن أهداف مثل theophylline. وهو يغطي تحضير العينة، وتضخيم الإشارة، وتطور اللون.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- الكيمياء التحليلية
- التكنولوجيا الحيوية
خلفية علمية
- الأبتامرات هي جزيئات قصيرة من RNA أو DNA أحادية السلسلة يمكنها الارتباط بأهداف محددة.
- يعد تضخيم الإشارة أمراً بالغ الأهمية للكشف عن الأهداف ذات الوفرة المنخفضة.
- يمكن أن تكون طرق الكشف البصري مفيدة في البيئات ذات الموارد المحدودة.
- يعد التعامل الدقيق مع الكواشف ضرورياً للحصول على نتائج دقيقة.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة سريعة للكشف عن الثيوفيلين تمييزاً له عن الكافيين.
- توفير بروتوكول "وعاء واحد" (one-pot) لتضخيم الإشارة.
- تمكين التحديد الكمي للنتائج باستخدام منحنى معايرة.
الطرق المستخدمة
- تنشيط نواتج قطع الريبوزيم باستخدام كيناز متعدد النيوكليوتيد T4.
- الكشف البصري عن أحداث الارتباط.
- القياس الكمي باستخدام أجهزة تعتمد على الامتصاصية.
- الخلط الدقيق والتبريد للمفاعلات لتقليل إشارة الخلفية.
النتائج الرئيسية
- تسمح هذه الطريقة بالكشف عن الثيوفيلين في العينات.
- يمكن تفسير النتائج بصرياً أو قياسها كمياً.
- تعد الدقة في التعامل مع المحاليل أمراً بالغ الأهمية لتحقيق نتائج ناجحة.
- يمكن تقليل إشارات الخلفية من خلال الإدارة السليمة للكواشف.
الاستنتاجات
- تعد المقايسة القائمة على الأبتامر طريقة سريعة وفعالة للكشف عن الهدف.
- يمكن تطويع هذه الطريقة لتطبيقات متنوعة في البيئات ذات الموارد المحدودة.
- قد تستكشف الدراسات المستقبلية أهدافاً إضافية وتحسيناً للبروتوكول.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
توفر أنظمة الكشف القائمة على الأبتمر مع التضخيم الأسي متساوي الحرارة مخرجات سريعة وحساسة وقابلة للتفسير بصرياً للتحقق من الهدف في سير عمل الاكتشاف المبكر. يتيح بروتوكول تضخيم G-quadruplex المكون من ثلاث مراحل قراءات نوعية وكمية، مما يدعم اتخاذ قرارات قوية عند نقاط التحول في تطوير المقايسة والمسح. يعزز هذا النهج الثقة التنبؤية فيما يتعلق بارتباط الهدف والخصوصية، مما يؤثر بشكل مباشر على فرز المحفظة وجاهزية المقايسة اللاحقة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- يتيح الاستجواب المباشر لأحداث التعرف الجزيئي باستخدام خصوصية الأبتامر.
- يدعم التحقق الوظيفي من ارتباط الهدف من خلال مخرجات يمكن اكتشافها بصرياً.
- يسهل التقييم السريع لارتباط الهدف من أجل تقليل المخاطر الميكانيكية.
- يعزز الثقة في انتقائية الهدف من خلال التمييز بين المواد التحليلية ذات الصلة الوثيقة.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر بروتوكولاً موحداً في وعاء واحد لإعداد مقايسة قابلة للتكرار.
- يقدم مخرجات كمية عبر قياس الامتصاصية لتقييم موثوق للمركبات.
- يتيح الفحص السريع للعينات بأقل المتطلبات من الأجهزة.
- يدعم التكميم القائم على منحنى المعايرة لتوحيد المقايسة.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- يوفر إمكانية التكيف مع المؤشرات الحيوية ذات الصلة بالمرض عند دعمه بتصميم الأبتمر.
- يحافظ على الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من خلال تنسيقات كشف قابلة للتوسع.
- يقلل من مخاطر النتائج الإيجابية الكاذبة عن طريق تقليل إشارة الخلفية باستخدام بروتوكولات محسنة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يتناسب نظام aptamer-EXPAR هذا ضمن التسلسل الممتد من الاكتشاف المبكر إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر جسراً يربط بين التعرف الجزيئي وتطوير المقايسات الكمية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تأكيد وجود الهدف وخصوصيته.
- الفحص: توفر مخرجات كمية قابلة للتكرار ومناسبة للإعدادات عالية الإنتاجية أو البيئات محدودة الموارد.
- التحليلات: تتيح القياس القائم على الامتصاصية وإنشاء منحنى قياسي للتحليل المقارن.
- الأبحاث الترجمية: يمكن تكييفها للكشف عن المؤشرات الحيوية في حال إثبات خصوصية الأبتامر.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تسمح نمطية البروتوكول بالتكيف مع أهداف جديدة عن طريق استبدال نطاقات الأبتامر.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الهدف.
- القيمة التشغيلية: تبسط سير العمل من خلال بروتوكول سريع ومعياري وقابل للتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات أسرع بشأن المتابعة أو الإيقاف وتطوير اختبارات ذات كفاءة في استخدام رأس المال.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال توفير بيانات كشف كمية وقوية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصميم الأبتامر والتعامل مع الأحماض النووية.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة البيولوجيا الجزيئية الأساسية وأجهزة قراءة الامتصاص للأطباق (absorbance plate readers) لغرض التكميم.
- يتطلب تعاملاً دقيقاً مع الكواشف وتحكماً في درجة الحرارة لتقليل إشارة الخلفية.
- يمكن تكييف البروتوكول مع أهداف مختلفة عن طريق تعديل النطاق الأبتامري.
- من الضروري إجراء تحسين دقيق لضمان النوعية وتقليل النتائج الإيجابية الكاذبة.
