مقايسة بقعة الفراغ في الوقت الحقيقي

يمكن استخدام الطريقة الموضحة في هذا التقرير لفهم الجوانب الفسيولوجية والسلوكية العصبية للتبول الطوعي في حالات الصحة والمرض. تسمح لنا هذه التقنية بمراقبة سلوك حجم الماوس في المراحل الفاتحة والمظلمة من اليوم ، وتوفر معلومات زمنية ومكانية وحجمية حول أحداث الإفراغ. لتحضير مقايسة بقعة الفراغ في الوقت الفعلي أو غرفة تسجيل RT-VSA، ضع ورق ترشيح رفيعا أو سميكا، حسب الوقت من اليوم، في الجزء السفلي من قفص التسجيل RT-VSA.

في الجزء العلوي من ورق الترشيح ، ضع كوخ الإسكيمو البلاستيكي لمساحة النوم ؛ أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل لأغراض التخصيب ؛ وطبق بلاستيكي 60 مم × 15 مم يحتوي على قطعتين أو ثلاث قطع من تشاو جاف للفأر ؛ و 14 إلى 16 جراما من الماء على شكل عبوة هلامية. بمجرد أن تصبح حجرة التسجيل جاهزة ، ضع الماوس برفق على ورق الترشيح. تأكد من أن نقل الماوس من قفص السكن إلى قفص التسجيل يحدث بأقل قدر من الضغط.

بمجرد أن يكون الماوس داخل قفص التسجيل ، ضع الغطاء وقم بتغطية الجزء العلوي من الغطاء بوسادة زرقاء ماصة لتقليل انعكاسات الضوء المحيط المباشرة على سطح غطاء زجاج شبكي. قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية في الغرفة السفلية. لتسجيل فيديو RT-VSA من الكاميرات العلوية والسفلية, استخدم برنامج تسجيل المراقبة بالفيديو الذي تم تكوينه للتسجيل في وقت واحد من كاميرات ويب متعددة أو كاميرات متصلة بالشبكة.

ابدأ التسجيل بالضغط على Cmd R في نافذة البرنامج. قم بإجراء تسجيلات الفيديو بمعدل إطار واحد في الثانية. مباشرة بعد بدء التسجيلات ، اخرج من الغرفة وأغلق الباب برفق.

تأكد من بقاء الغرفة هادئة للتجربة بأكملها. أوقف التسجيلات بالضغط على Cmd T.قم بإيقاف تشغيل الأضواء فوق البنفسجية. بعد إيقاف التسجيل ، يقوم البرنامج تلقائيا بإنشاء ملف فيلم بتنسيق m4v لكل كاميرا وحفظه تحت اسم الكاميرا في مجلد وجهة محدد مسبقا.

تحقق من أن التجارب داخل مجلد كل كاميرا منظمة في مجلدات حسب التاريخ. في كل مجلد تاريخ أو تجربة، تحقق من وجود ملف m4v واحد وجميع ملفات jpeg الفردية التي تتوافق مع كل إطار فيلم. قم بإنشاء مجلد على سطح المكتب باسم التجربة وتاريخها ونقل ملفات m4v إلى هذا المجلد.

انسخ مجلد الفيلم إلى محرك أقراص محمول لتحليله على كمبيوتر خارجي. افتح ملف فيلم تم جمعه بواسطة الكاميرا السفلية أثناء مرحلة الضوء أو الكاميرا العلوية أثناء المرحلة المظلمة لتحليله. بعد تقييم جودة الفيلم ، قم بتحليل التجارب بالانتقال إلى النافذة الزمنية الصحيحة باستخدام أمر التقديم السريع أو شريط تمرير شريط الوقت.

يتم تسجيل نشاط الإفراغ خلال مرحلة الضوء بين الساعة 11:00 صباحا و 5:00 مساء ، وخلال المرحلة المظلمة ، بين منتصف الليل و 6:00 صباحا. قم بتشغيل الفيلم في وضع التقديم السريع بالنقر فوق رمز التقديم السريع أو التمرير يدويا خلال الفيلم ، بحثا عن دليل على أن الماوس يفرغ. ابحث عن الظهور المفاجئ لبقع البول الساطعة على ورق الترشيح أو التغيرات السلوكية ، بما في ذلك الحركة إلى زوايا القفص وفترة وجيزة من عدم النشاط عندما يكون الفأر فارغا. سجل الوقت الذي يحدث فيه كل فراغ.

كاتفاقية ، يتم تسجيل وقت الفراغ عند أول علامة على اكتشاف البول. لأخذ قياسات الفراغ ، استخدم أولا شريط التمرير للتحرك للأمام أو للخلف في الوقت المناسب ، بحثا عن النقطة التي حدث فيها أقصى انتشار لبقعة البول. أوقف الفيلم مؤقتا عند هذه النقطة وضع سهم فأرة الكمبيوتر في المكان قيد التحليل لتحديد نقطة الاهتمام في لقطة الشاشة.

قم بتسمية ملف لقطة الشاشة باستخدام الأرقام المرتبطة لحساب ترتيب الظهور في الفيلم. بمجرد تحليل جميع البقع الفارغة ، قم بقياس المساحة الإجمالية لورق الترشيح عن طريق التقاط لقطة شاشة وتحديد حدود ورق الترشيح. احسب النسبة المئوية لمساحة كل بقعة من بقع البول.

قم بتحويل قيم مساحة النسبة المئوية إلى حجم البول لكل بقعة فراغ باستخدام منحنيات المعايرة ووظيفة الاستيفاء في برنامج الرسوم البيانية. تم تسجيل سلوك الإفراغ للإناث والذكور Piezo1 ، 2 ، بالضربة القاضية والفئران الضابطة خلال المرحلة المظلمة والخفيفة من اليوم. خلال مرحلة الضوء غير النشطة ، لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في أي معلمات تم تحليلها لإناث أو ذكور الفئران بالضربة القاضية مقارنة بالسيطرة.

ومع ذلك ، في المرحلة المظلمة النشطة ، أظهرت الفئران بالضربة القاضية من الإناث والذكور النمط الظاهري للإفراغ المتغير ، والذي يتميز بزيادة كبيرة في عدد وحجم بقع الفراغ الصغيرة وحجمها. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في بقع الفراغات الأولية أو عدد PVS ، أو متوسط الحجم لكل PVS ، أو إجمالي حجم PVS في إناث أو ذكور الفئران بالضربة القاضية مقارنة بالفئران الضابطة. تم اختبار سلوك إفراغ إناث الفئران تحت الظروف القاعدية وبعد العلاج بسيكلوفوسفاميد.

بالمقارنة مع الظروف القاعدية ، تكون كمية إطلاق البول لكل فراغ أصغر بعد العلاج بسيكلوفوسفاميد وتكون أحداث التبول أكثر تواترا. أحد الجوانب الرئيسية لاستنساخ الفحص هو التلاعب بالحيوانات برفق قدر الإمكان وإبقائها تحت الحد الأدنى من الضغط خلال فترة الاختبار بأكملها. نظرا لأن هذا اختبار غير جراحي ، يمكن إجراء إجراءات إضافية بعد ذلك بما في ذلك قياس الخلايا وتخطيط كهربية العضل لتقييم وظائف العضلة العاصرة للمثانة والإحليل الخارجي على التوالي.

سيسمح تنفيذ هذه التقنية للباحثين بتحديد مساهمة مسارات محددة في إفراغ السلوك في حالات الصحة والمرض.