تصوير الفاصل الزمني 3-D لديناميات جدار الخلية باستخدام Calcofluor في الطحالب Physcomitrium patens

يسمح التصوير بفاصل زمني باستخدام الفحص المجهري الفلوري بمراقبة التغيرات الديناميكية للنمو والتطور على المستويين الخلوي ودون الخلوي. يمكن لهذا البروتوكول البسيط للتصوير بفاصل زمني 3D دراسة ديناميكيات جدار الخلية مباشرة على مدى فترة طويلة. يستخدم هذا البروتوكول صبغة كالكوفلور لتحديد ديناميكيات سمك جدار الخلية ، وبالتالي لا يتطلب تحويل بروتين الفلورسنت.

إشارات الكلكوفلور مستقرة ويمكن أن تستمر لأكثر من أسبوع. يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنظمة الأخرى ذات الهياكل البسيطة التي تحتوي على جدران الخلايا ويمكن تلطيخها بالكالكوفلور كما هو الحال في النباتات المزهرة. في هذا البروتوكول ، تكون إشارات الكلكوفلور مستقرة عندما يتم خلط هذه الصبغة داخل الوسط أثناء عملية التصوير بفاصل زمني بأكملها.

للبدء ، قم بتفريق أنسجة الطحالب البالغة من العمر سبعة أيام في أنبوب صغير سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 20 ميكرولتر من الماء المعقم. بالنسبة للنوع البري ، استخدم ملقط لفصل البروتونيماتا. بالنسبة لمتحولة ggb ، افصل البروتونيماتا باستخدام ماصة AP-1000.

أضف 10 ميكرولتر من الكالكوفلور الأبيض المعقم إلى الأنبوب الصغير واترك الأنبوب في وضع مستقيم في الغطاء لمدة دقيقتين للتلطيخ. مباشرة بعد التلوين ، امزج النباتات مع 200 ميكرولتر من BCDATG المبرد الذي يحتوي على وسط BCDAT عن طريق سحب خمس مرات باستخدام ماصة P1000 ونقل الخليط إلى طبق قاعدة زجاجية 27 ملم. تأكد من توزيع 200 ميكرولتر من BCDATG مع العينات بالتساوي على سطح الطبق السفلي الزجاجي 27 ملم لإنتاج طبقة رقيقة من الفيلم بحيث تكون العينات ضمن مسافة العمل الموضوعية أثناء التصوير.

بعد التصلب لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، قم بتغطية الطبقة الرقيقة بثلاثة ملليلتر من BCDATG المبرد واتركها لمدة 10 دقائق لتتصلب مرة أخرى. في الجزء السفلي من الطبق ، ارسم تسعة خطوط في اتجاهات متوازية ومتعامدة وقم بتمييز الصفوف بأحرف من A إلى H ، والأعمدة ذات الأرقام من واحد إلى ثمانية. استخدم العلوي والسفلي والأيمن والأوسط والأيسر لتمييز المواضع داخل كل مربع.

على سبيل المثال ، إذا كان النبات في مربع في الصف الثاني ، في العمود السادس وتم وضعه في الجزء الأيسر العلوي من المربع ، إعطاء هذا النبات اسم b6 العلوي الأيسر. ضع الطبق ذو القاع الزجاجي تحت الضوء الأبيض لمدة يوم إلى يومين قبل الخضوع لتصوير الفاصل الزمني كل يوم ، لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد ، افتح ملف ND2 وانقر فوق وحدة التخزين.

أعد بناء الجدار الخلوي في اليوم صفر، واليوم الأول، واليوم الثالث، واليوم الرابع. بعد التقاط كل صورة ، ضع الطبق الزجاجي مرة أخرى في غرفة النمو. تم عرض التغيرات الديناميكية في الجدران المتقاطعة من خلال تلطيخ الكالكوفلور الأبيض في النوع البري ، وطفرات ggb.

بالنسبة لمتحولات ggb ، تشير الخطوط المتقطعة البيضاء أسفل كل صورة إلى جدار الخلية السطحي المكسور في الخلايا المتوسعة وتشير الخطوط البرتقالية إلى الخلايا الموجودة أسفل سطح جدار الخلية في ggb. يمكن الكشف عن الاختلافات في إشارة الكالكوفلور البيضاء على المواضع السطحية للخلايا والمناطق الأقل كثافة تشير إلى توسع الخلايا في طفرات ggb أو المواقع المتفرعة حديثا في النوع البري. بالنسبة للاستزراع المسبق من النوع البري ، يلزم وجود نباتات في ضوء أحمر ضعيف من الأعلى لمدة خمسة أيام لتحفيز استجابات الانتحاء الضوئي للبروتونيماتا بحيث يمكن ربط النباتات بقاع الأطباق ويمكن ظهور النباتات ضمن مسافة العمل المستهدفة أثناء التصوير لأنه يمكن استخدام الكالكوفلور الأبيض مع صبغة أخرى مثل الكرة المجهرية.

يمكن أيضا دراسة معلومات إضافية حول توسع الخلية. تعد ديناميكيات جدار الخلية النباتية أمرا بالغ الأهمية لتحقيق النمو والتطور بكفاءة وكذلك للاستجابة للإشارة البيئية. يسمح هذا البروتوكول بتقسيم التغييرات في إشارات جدار الخلية وتكاملها.