التصوير في الوقت الحقيقي من النبات خلية سطح حيوية مع زاوية المتغير المجهر epifluorescence

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة حركة البروتينات ذات العلامات الفلورية على أسطح الخلايا النباتية باستخدام الفحص المجهري الفلوري epi متغير الزاوية. يمكن أن يساعدنا هذا الوعاء في التقدم في مجال بيولوجيا الخلايا النباتية ، مثل كيفية عمل البروتين على أسطح الخلايا اللوحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتصور ديناميكيات الوقت الفعلي لبروتينات هجوم الفلورسنت قبل بدء الإجراء.

معايرة توسيط الليزر وتركيز المجهر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم استخدم مسار إضاءة موضوعي خال من العدسة لتحديد موقع مركز سقف غرفة الفحص المجهري وتحديد الموضع بختم ملون. بعد ذلك ، قم بإضاءة السقف بعدسة موضوعية وحرك المنطقة المضيئة إلى الوضع المركزي.

ثم قم بتركيز الليزر وضبط موضع الليزر على مركز السقف. يعد توسيط الليزر وتركيزه أمرا مهما جدا لمجهر رائحة epi متغير الزاوية الناجح أو مراقبة VAEM. يجب تدريب المستخدمين من قبل موظف محترف من شركة المجهر قبل بدء التجربة.

عندما يكون المجهر جاهزا ، قم بتوزيع 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت القاعدي على وسط شريحة زجاجية مقاس 76 × 26 ملم. ثم استخدم مقص التشريح لإزالة الرصاص المشترك من شتلة عمرها سبعة أيام وتعويم الرصاص المشترك مع جانب الملاحظة لأعلى على قطرة العازلة القاعدية. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت القاعدي إلى وسط 18 × 18 ملم.

قم بتغطية الزجاج واقلب زجاج الغطاء رأسا على عقب. سيمنع التوتر السطحي بلطف السقوط ، ويمسك زجاج الغطاء بالملاقط على حافة واحدة. ضع الحافة المقابلة على الشريحة الزجاجية بحيث يكون المخزن المؤقت فوق المدخل المشترك.

ثم احتفظ بحافة زجاج الغطاء على الشريحة. اضبط موضع القطرة بحيث تكون فوق عينة الأولين مباشرة وقم بإسقاط زجاج الغطاء. إذا لم تكن هناك فقاعات هواء ، فاستخدم مناديل خالية من النسالة لمسح المخزن المؤقت الزائد ونقل المستحضر على الفور إلى المجهر.

باستخدام إضاءة المجال الساطع ، حدد الخلايا للمراقبة. بعد ذلك ، تأكد من أنه يمكن ملاحظة البروتين الفلوري واستخدم إضاءة مضان epi لضبط موضع المحور Z على سطح الخلية. لإجراء VAEM ، استخدم صندوق التحكم لإمالة زاوية دخول شعاع الليزر.

تدريجيا أثناء مراقبة الصورة الحية بعناية. في البداية ، ستظهر الصورة غير واضحة. مع زيادة زاوية الليزر ، ستصبح صورة VAEM أقل ضبابية ، مما ينتج عنه في النهاية صورة واضحة.

في هذه المرحلة ، توقف عن زيادة زاوية الليزر. الآن بخير. اضبط زاوية دخول الليزر للحصول على صورة أفضل ، واضبط معلمات مستشعر الصور البصري حسب الضرورة.

ثم باستخدام برنامج المجهر التجاري ، احصل على فيلم كملف صورة TIFF متعدد الصفحات. هنا يظهر الفيلم نقاطا مسماة GFP تومض على سطح خلايا نموذج STA. لتحديد وقت إقامة GFP المسمى DOT باستخدام فيجي ، انتقل إلى القائمة المفتوحة للملف ، وافتح ملف التلميح متعدد الصفحات المكتس.

استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لوضع خط على جانب الاهتمام. بعد ذلك ، استخدم المكون الإضافي لشريحة الدقة الديناميكية لمكدسات الصور لإنشاء صورة رسم بياني. مع تغير الخط ، ستتغير صورة الرسم البياني ديناميكيا.

احفظ الصورة كملف TIFF أسفل الملف ، واحفظها كقائمة tiff. ثم لإجراء تقليل التشويش ، انتقل إلى مرشحات العملية قائمة التمويه Gaussian ، وقم بتطبيق مرشح Gaussian على صور الكرونوغراف. يجب ضبط معلمة نصف قطر سيجما حسب الضرورة.

باستخدام أداة ضبط عتبة الصورة، قم بتقسيم مناطق الإشارة عن طريق تحديد العتبة وافتح قائمة تحليل مجموعة القياسات. بعد ذلك ، تحقق من المستطيل المحيط في نافذة تعيين القياسات ، وحدد الحد الأدنى لعدد وحدات البكسل الممكنة. ثم ضمن التحليل ، قم بتحليل قائمة الجسيمات.

قم بقياس وقت نقطة الاهتمام مقابل المحور Y وتحقق من نتائج العرض وأضفها إلى مربعات المدير لعرض قيم البيانات. أخيرا ، ضمن قائمة جدول النتائج ، حدد ملف ، واحفظه باسم وقم بمعالجة مجموعة بيانات فترات الصور النقطية باستخدام برنامج التحليل المناسب. هنا ، تظهر أوقات الإقامة ل 185 دورية GFP نقطة واحدة من 12 خلية فرعية مستقلة في الدين الثامن كما تم قياسها بواسطة تحليل الرسم البياني chm كما هو موضح في الرسم البياني.

كشفت وظيفة الكثافة المجهزة أن معظم النقاط الواحدة لدورية GFP كانت موجودة في خلية فرعية لمدة تتراوح بين ثانيتين و 10 ثوان مع ذروة تبلغ حوالي 3.5 ثانية. يشير هذا إلى خلوت خلوية سريعة لمضخات البروتون على سطح الخلية الفرعية. بعد العمل على هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وقياس ديناميكيات البروتين من النوع العصبي على سطح الخلية النباتية باستخدام الفحص المجهري الفلوري epi متغير الزاوية.