تقييم سريع للسمية الخلوية في المختبر لمستقبلات المستضد الخيمري المعبرة عن Jurkat باستخدام التصوير الفلوري
أكتوبر 27, 2023
بروتوكول لتقييم القتل الكمي للخلايا السرطانية بواسطة خلايا جوركات التي تعبر عن مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) التي تستهدف مستضد الورم المفرد. يمكن استخدام هذا البروتوكول كمنصة فحص للتحسين السريع لتركيبات مفصلات CAR قبل التأكيد في الخلايا التائية المشتقة من الدم المحيطي.
يتم تحسين الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية باستمرار لتحقيق استجابات أفضل في التجارب السريرية البشرية. نحن نحدد طرقا لتقييم ذلك في مختبرنا باستخدام طريقة إنتاجية عالية غير متحيزة ، مثل استخدام التصوير الفلوري لفحص المجموعات التي تعمل بشكل أفضل. هناك عدة مجموعات من التركيبات التي يمكن تصميمها لأي جزء متغير سلسلة واحدة عن طريق تعديل هندسة المجالات خارج الخلية والمفصلات.
لقد صممنا هذا البروتوكول لتحديد التوليفات بأفضل فعالية في القضاء على الخلايا المستهدفة باستخدام خلايا Jurkat. هذا بروتوكول سريع وعالي الإنتاجية لفحص تركيبات CAR بناء على السمية الخلوية للخلية المستهدفة باستخدام خلايا Jurkat ، والتي يتم التحقق من صحتها بعد ذلك باستخدام الخلايا التائية التقليدية. يمكن اختبار عشرات التركيبات المختلفة ل CAR في لوحة 96 بئرا في وقت واحد باستخدام هذه التقنية.
هنا في مختبر أخافان ، نحدد بالأرقام المطلقة التدوير المباشر للخلايا المستهدفة بواسطة CAR الذي يعبر عن خلايا Jurkat بطريقة إنتاجية عالية لفحص تركيبات CAR المتعددة. الهدف الأساسي لمختبرنا هو تحسين الترجمة السريرية للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية ضد أورام الدماغ عالية الدرجة. نحن نستفيد من شاشات الأدوية عالية الإنتاجية كطريقة واحدة لتحسين السمية الخلوية للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية ، بالإضافة إلى استهداف البيئة المكروية للورم.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة عالية الإنتاجية لتقييم السمية الخلوية لخلايا Jurkat التي تعبر عن CAR ضد الخلايا الورمية. وتسمح هذه الطريقة بالفحص السريع لبنى CAR المختلفة لتحديد التركيبات الأكثر فعالية لاستهداف مستضدات ورمية محددة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم المناعة
- بيولوجيا السرطان
- العلاج الخلوي
الخلفية العلمية
- يتم حالياً تطوير خلايا CAR T لتحسين النتائج السريرية.
- تعد طرق الفحص عالية الإنتاجية ضرورية لتحسين تركيبات CAR.
- تُستخدم خلايا Jurkat كنموذج لتقييم فعالية CAR.
- تركز هذه الدراسة على السمية الخلوية لتركيبات CAR ضد الخلايا المستهدفة.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لفحص تركيبات CAR بكفاءة.
- قياس التأثيرات السامة للخلايا لـخلايا Jurkat التي تعبر عن CAR.
- تحديد تكوينات CAR المثلى لاستهداف المستضدات الورمية.
الطرق المستخدمة
- التصوير الفلوري للفحص عالي الإنتاجية.
- تقييم بنيات متعددة من مستقبلات المستضد الخيمرية (CAR) في تنسيق لوحة ذات 96 بئراً.
- قياس كمية قتل الخلايا المستهدفة بواسطة خلايا Jurkat التي تعبر عن CAR.
- المقارنة مع استجابات الخلايا التائية التقليدية للتحقق من الصحة.
النتائج الرئيسية
- تحديد بنيات CAR الفعالة لقتل الخلايا الورمية.
- إثبات قدرات الإنتاجية العالية باستخدام خلايا Jurkat.
- التقييم الكمي للسمية الخلوية عبر البنيات المختلفة.
- إمكانية التحسين السريع لتصاميم CAR قبل التطبيق السريري.
الاستنتاجات
- يتيح هذا البروتوكول الفحص الفعال لبنى مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR constructs).
- توفر خلايا Jurkat نموذجاً موثوقاً لتقييم فاعلية مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR).
- يمكن لهذا النهج أن يسرع من تطوير علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR T cell therapies).
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التقييم السريع وعالي الإنتاجية للسمية الخلوية لبنى CAR في خلايا Jurkat تقليل المخاطر في المراحل المبكرة وتحديد أولويات تصميمات CAR قبل الانتقال إلى مرحلة التحقق من صحتها باستخدام الخلايا التائية الأولية التي تتطلب موارد مكثفة. وتعمل هذه المنصة على تسريع تحديد بنى CAR المحسنة من حيث منطقة المفصل (hinge) والتي تتميز بقدرة فائقة على قتل الخلايا المستهدفة، مما يدعم الفرز الفعال للمجموعة في مسارات تطوير العلاج الخلوي للأورام. ومن خلال قياس السمية الخلوية لعدة بنى في وقت واحد، يمكن للفرق اتخاذ قرارات قائمة على البيانات عند نقاط التحول الحرجة في عملية الاكتشاف.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الاستقصاء السريع لتبديلات بنية CAR من أجل التحقق الوظيفي من الهدف.
- يدعم الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال قياس السمية الخلوية المباشرة في نظام محكوم.
- يسهل الثقة التنبؤية في اختيار البنية قبل البدء في الهندسة الأولية للخلايا التائية.
الفحص وتطوير المقايسة
- تجهيز أنظمة CAR-Jurkat المعتمدة لسير عمل عمليات الفحص عالية الإنتاجية اللاحقة.
- توحيد مقاييس السمية الخلوية باستخدام مخرجات التصوير الفلوري الكمية.
- تمكين التقييم القابل للتطوير والتكرار لعدة بنى CAR بشكل متوازٍ.
- دعم التقييم الموثوق للمركبات أو البنى في تنسيقات الأطباق ذات الـ 96 بئراً.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يوائم بيانات السمية الخلوية المبكرة مع الأهداف الانتقالية من خلال تأكيد النتائج في الخلايا التائية المشتقة من خلايا PBMC.
- يوفر استمرارية من مرحلة تحسين البنية في مرحلة الاكتشاف إلى خطوات التحقق قبل السريرية.
- يقلل من مخاطر التوقف في المراحل المتأخرة عن طريق تصفية تصميمات CAR غير المثالية في وقت مبكر.
تكامل تدفق العمل والمسارات التحليلية
تتناسب منصة قياس السمية الخلوية عالية الإنتاجية هذه عند نقطة التلاقي بين مرحلتي الاكتشاف المبكر وتحديد المركبات الواعدة، حيث تربط بين تصميم البنى الجينية والتحقق قبل السريري. وهي تتيح الاختبار السريع للفرضيات وفرز البنى الجينية قبل الانتقال إلى الدراسات الأساسية للخلايا التائية أو الدراسات الحيوية داخل الجسم التي تتطلب موارد مكثفة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم التقييم القائم على الفرضيات لتعديلات المفصلة (hinge) والنطاق خارج الخلوي (extracellular domain) لفعالية CAR.
- الفحص: يوفر بيانات كمية وقابلة للتكرار عن السمية الخلوية لمقارنة وتصنيف البنى الجزيئية.
- التحليلات: يوفر أعداداً مطلقة للخلايا ومخرجات إحصائية (مثل one-way ANOVA) لدعم اتخاذ القرار.
- الأبحاث الانتقالية: يؤكد أداء البنى الجزيئية في الخلايا التائية المشتقة من PBMC، مما يدعم الاستمرارية الانتقالية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة قابلة للتوسع وإعادة الاستخدام لحملات تحسين بنى CAR المستمرة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في اختيار بنية CAR.
- القيمة التشغيلية: توحد وتقيس تقييم السمية الخلوية، مما يتيح تخصيصاً فعالاً للموارد.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات الاستمرار أو التوقف (go/no-go) وكفاءة رأس المال من خلال تصفية البنى في مرحلة مبكرة.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بمرشحي CAR.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصميم بنية CAR والتحول العدواني للفيروسات البطيئة (lentiviral transduction) لخلايا Jurkat.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة التصوير الفلوري وبرمجيات تحليلية للحصول على قراءات كمية.
- يستلزم توحيد معايير إعداد المقايسة ومعاملات تحليل البيانات بين الفرق المختلفة.
- قد يتطلب التكييف مع نماذج خلوية أو مستضدات أخرى تحسيناً للبروتوكول.
- يعتمد على تحليل إحصائي قوي (مثل ANOVA) لمقارنة البنى.
الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![التصوير الديناميكي للخلايا التائية لمستقبلات المستضدات الكيميرية مع [18F] التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني رباعي فلوروبورات / التصوير المقطعي المحوسب](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
