قياس سمية الخلايا غير السرطانية التي تعزز بواسطة مستقبلات المستضدات الكيميرية والأجسام المضادة العلاجية باستخدام تصوير الخلايا الحية وقياس خلوية التدفق

يدرس مختبرنا دور الخلايا القاتلة الطبيعية في حالتي الصحة والمرض، بهدف تسخير إمكاناتها لتحسين علاجات سرطانات الدم والأورام الصلبة. تفتقر فحوصات السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية الحالية إلى التوحيد القياسي عبر المنصات والتجهيزات المختلفة. يوفر هذا البروتوكول طرقاً قابلة للتكرار للتصوير الحي للخلايا وقياس التدفق الخلوي لتقييم دقيق للسمية الخلوية.

للبدء، قم بتحضير 10 milliliters من 2x SYTOX Orange عن طريق تخفيف المحلول المخزون من SYTOX Orange في وسط استزراع NK-92 داخل أنبوب طرد مركزي بقاع مخروطي سعة 15-milliliter. قم بعد الخلايا المستهدفة باستخدام Luna Counter بعد الخلط مع Trypan Blue، أو استخدم أي طريقة معتمدة لعد الخلايا تعتمد على استبعاد الصبغة. انقُل الكمية المطلوبة من الخلايا المستهدفة إلى أنبوب طرد مركزي بقاع مخروطي سعة 15-milliliter.

قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 300G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من الطافي. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا المستهدفة للوصول إلى تركيز نهائي قدره 250, 000 خلية لكل ملليلتر في وسط 2X SYTOX Orange. ولتحضير الخلية المؤثرة، قم بتقييم حيوية وتركيز خلايا NK-92، ولا تشرع في العمل إلا إذا كانت الحيوية أكبر من 80%، حيث إن انخفاض الحيوية قد يؤثر على أداء المقايسة.

قم بعدّ ونقل العدد المطلوب من خلايا NK-92 إلى أنابيب طرد مركزي فردية ذات قاع مخروطي سعة 15 milliliter. بعد عملية الطرد المركزي، أعد تعليق الخلايا لتصل إلى تركيز نهائي قدره 500, 000 خلية لكل milliliter. قم بتحضير تخفيفات الخلايا المؤثرة عن طريق إضافة 240 microliters من الخلايا المؤثرة إلى آبار طبق ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً لتحقيق نسبة مؤثر إلى هدف تبلغ 2:1، وأضف 120 microliters من الوسط الزرعي إلى الآبار المتبقية.

أجرِ تخفيفات تسلسلية بمقدار الضعف لنسب الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة من 2:1 إلى 1:1 ثم إلى 0.25:1، مع الخلط جيداً عن طريق السحب والضخ بالماصة خمس مرات على الأقل وتغيير الرؤوس بين عمليات النقل. بعد ذلك، ولتجهيز المزرعة المشتركة، أحضر طبق 96 بئراً مسطح القاع ومطلياً بالبولي ليسين. وقبل النقل مباشرة، أعد تعليق الخلايا المستهدفة والمؤثرة جيداً دون تكوين فقاعات، ثم أضف 100 µL من كل معلق خلوي إلى الآبار المناسبة.

بعد ذلك، أضف 200 µL من PBS إلى الآبار المحيطة غير المستخدمة. قم بطرد الطبق مركزياً عند 100G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ضع الطبق في نظام تصوير الخلايا الحية.

التقط الصور كل ساعة واحدة لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% carbon dioxide. تحقق من جودة الصورة بعد المسح الأول واضبط إعدادات التصوير إذا لزم الأمر. اضبط الفصل الطيفي (spectral unmixing) لتصحيح التداخل (spillover) لصبغة SYTOX Orange في القناة الخضراء.

تحقق من عدم الخلط بين الخلايا الميتة الموجبة للون البرتقالي والخلايا الموجبة للون الأخضر. لتهيئة تحليل كل خلية على حدة للخلايا غير الملتصقة، اضبط قطر الجسم المتوقع على 15 micrometers ليتناسب مع قطر الخلية التقريبي. اضبط حساسية العتبة وحساسية النسيج على القيمة خمسة، وحساسية الحواف على 10 لتسهيل فصل تجمعات الخلايا.

اضبط نطاق مرشح مساحة الأجسام المقبولة من 50 إلى 2,000 square micrometers لاستبعاد الحطام والأجسام الكبيرة. واضبط الحد الأقصى للانحراف المركزي (eccentricity) على 0.95 لاستبعاد الأجسام غير الخلوية. احصل على خلايا NK بشرية أولية تم استزراعها لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة.

انقل 500,000 من الخلايا المستهدفة إلى أنبوب طرد مركزي بقاع مخروطي سعة 15 milliliter. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 milliliters من PBS. قم بإجراء الطرد المركزي للخلايا عند 300G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة السائل الطافي. حضّر محلول عمل بتركيز 0.5 micromolar من carboxyfluorescein succinimidyl ester أو CFSC في PBS عن طريق تخفيف 1 microliter من المحلول المخزون لـ CFSE بتركيز 5 millimolar في 10 milliliters من PBS. أعد تعليق الراسب الناتج بتركيز تقريبي يصل إلى مليون خلية لكل milliliter في محلول CFSE.

يُحضن الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، مع تغليفها بورق الألومنيوم لحمايتها من الضوء. بعد ذلك، يتم إيقاف التفاعل بإضافة من خمسة إلى 10 أحجام من وسط الزرع، ثم تُحضن لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد طرد الخلايا مركزياً، يُعاد تعليق كتلة الخلايا بحيث يكون التركيز 250, 000 خلية لكل مليلتر، ليكون هناك 25, 000 خلية في كل 100 ميكرولتر.

أضف 100 µL من الخلايا المستهدفة لكل بئر في الآبار المحددة من طبق بئر 96 ذو قاع مستدير باستخدام ماصة متعددة القنوات. يتم توزيع كل حالة في ثلاث مكررات. بعد ذلك، قم بتحضير 200 µL من محلول الأجسام المضادة بتركيز 4X في وسط زراعة خلايا NK لكل جسم مضاد مختبر وعينة تحكم متطابقة من النوع المناعي (isotype control).

انقل محاليل الأجسام المضادة إلى طبق ذو آبار عميقة. أضف 50 µL من محلول الجسم المضاد إلى كل بئر يحتوي على الخلايا المستهدفة، واخلط جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة خمس مرات على الأقل. أضف 50 µL من وسط زراعة خلايا NK لكل بئر في آبار التحكم الخالية من الأجسام المضادة، واخلط جيداً باستخدام الماصة.

حضّن الطبق لمدة تتراوح بين 25 إلى 30 دقيقة تحت ظروف التحضين القياسية. قم بعدّ والحصول على 200,000 من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells)، ولا تتابع العمل إلا إذا كانت نسبة الحيوية أكبر من أو تساوي 75%. أعد تعليق الخلايا بتركيز 250,000 خلية لكل مليلتر في 800 µL من وسط زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية الأولية. أضف 50 µL من الخلايا القاتلة الطبيعية لكل بئر في الآبار المقابلة، وامزجها جيداً عن طريق السحب والطرد بالممصّة خمس مرات على الأقل.

بعد ذلك، يتم سحب 50 µL من وسط الزرع لكل بئر ونقلها إلى آبار التحكم مع الخلط جيداً. افحص بعناية لوحة الـ 96 بئراً ذات القاع المستدير للتأكد من أن جميع الآبار تحتوي على 200 µL بمستويات سطحية (meniscus) موحدة وخالية من الفقاعات. يتم طرد اللوحة مركزياً لمدة دقيقتين عند 100G، ثم تُحضن لمدة تتراوح بين 16 إلى 18 ساعة تحت ظروف التحضين القياسية.

قم بطرد الطبق مركزياً لمدة خمس دقائق عند 300G وتخلص من الطافي. اغسل جميع الآبار باستخدام 200 µL لكل بئر من منظم الفرز الخلوي المنشط بالفلورة أو منظم FACS. قم بتحضير خليط رئيسي للأجسام المضادة السطحية في منظم FACS كما هو موضح هنا.

أعد تعليق الخلايا في 50 µL لكل بئر من المزيج الرئيسي للأجسام المضادة، واخلط جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة خمس مرات على الأقل. حضّن الطبق لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، مع لفه بورق ألومنيوم للحماية من الضوء. أضف 150 µL لكل بئر من محلول FACS المنظم.

بعد عملية الطرد المركزي، أعد تعليق الخلايا في 100 µL لكل بئر من DAPI بتركيز 5 µM في محلول FACS buffer. انتقل فوراً إلى مرحلة اكتساب البيانات باستخدام قياس التدفق الخلوي دون إجراء تحضين مسبق. قم بإجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام جهاز Cytek Aurora، وسجل قنوات الفلورة لكل من CFSE وBV421 وBV785 وPE-Cy7 وDAPI وأي فلوروفورات إضافية.

خلال الزراعة المشتركة، تم تصوير الخلايا المؤثرة والخلايا المستهدفة الحية والخلايا الميتة باستخدام مجهر الخلايا الحية في الوقت الفعلي. وأظهرت خلايا CAR2-NK-92 وCAR3-NK-92 حركية قتل أسرع من خلايا CAR1-NK-92، خاصة في النقاط الزمنية المبكرة عند نسبة متساوية من الخلايا المؤثرة إلى المستهدفة. وزاد قتل الخلايا المستهدفة مع ارتفاع نسب الخلايا المؤثرة إلى المستهدفة، بما في ذلك خلايا NK-92 الضابطة، التي أظهرت سمية خلوية طبيعية.

أظهرت خلايا NK-92 من نوع CAR2 وCAR3 فاعلية أكبر عند نسب أقل من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة في النقاط الزمنية المتأخرة. بينما لوحظت فاعلية معززة عند نسب متوسطة من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة في النقاط الزمنية المبكرة. وقد تم تحديد ثلاثة معايير، وهي KR50 وKT50 وIKI-50، لقياس فاعلية خلايا CAR-NK-92، وحركية القتل، والأداء العام للسمية الخلوية عبر مجموعات الخلايا المؤثرة.

لم تؤدِ إضافة daratumumab بمفرده إلى خفض بقاء الخلايا المستهدفة، مما يؤكد أن الجسم المضاد لم يكن له تأثير مباشر على حيوية الخلايا المستهدفة في غياب الخلايا الفعالة. وقد أدى الاستزراع المشترك مع خلايا NK بمفردها إلى خفض بقاء الخلايا المستهدفة إلى حوالي 70%، مما يشير إلى السمية الخلوية الطبيعية الأساسية. كما أدت إضافة daratumumab إلى خفض بقاء الخلايا بشكل أكبر لتصل إلى حوالي 37%، وهو ما يتوافق مع تعزيز السمية الخلوية بوساطة الأجسام المضادة.

وفي المقابل، أظهرت حالة التحكم بنوع البروتين المناعي (isotype control) نسبة بقاء بلغت حوالي 62%، وهي نسبة مماثلة لحالة خلايا NK وحدها. وكان تحلل حبيبات خلايا NK في أدنى مستوياته في حالة الزراعة المشتركة لخلايا NK مع الخلايا المستهدفة بدون أجسام مضادة، وفي أعلى مستوياته في الحالة المعالجة بعقار daratumumab بنسبة بلغت حوالي 31%، بينما أظهر التحكم بنوع البروتين المناعي تحللاً متوسطاً بنسبة بلغت حوالي 19%. يتيح هذا البروتوكول للباحثين قياس السمية الخلوية الطبيعية لخلايا NK، وتقييم القدرة القاتلة للأورام لتصميمات CAR-NK، ومقارنة فعالية ADCC للأجسام المضادة أحادية النسيلة. ومن الاعتبارات الأساسية عند تنفيذ هذا البروتوكول الحفاظ على دقة واتساق عد الخلايا، وعمليات السحب بالماصة، وتوزيع خلايا NK والخلايا المستهدفة في الأطباق لضمان الحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتفسير.

يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه البروتوكولات لاستكشاف التهرب المناعي للخلايا القاتلة الطبيعية (NK cell)، ومقارنة القابلية للإصابة بالأورام، وتقييم العلاجات المناعية الجديدة القائمة على الخلايا القاتلة الطبيعية عبر أنواع السرطانات المختلفة.