ميكروفلويديك طلبات للحصول على تشخيص احدة

اسمي كاثرين كلاود بريدج، وأنا أستاذة في التصنيع والهندسة والهندسة الطبية الحيوية في جامعة بوسطن. وأشغل منصب مدير مختبر الأجهزة والبيئات الدقيقة الطبية الحيوية. نحن نعمل بشكل أساسي على ابتكار أدوات تشخيصية قابلة للتخلص منها لاستخدامها في التطبيقات ضمن المناطق محدودة الموارد.

لذلك، نستخدم الموائع الدقيقة لتصنيع هذه الأجهزة. نحن مهتمون في الواقع بمجالي دراسة؛ حيث ينصب اهتمامنا الأساسي على بحث كيفية تفاعل الجزيئات الحيوية والخلايا مع أسطح البوليمرات البلاستيكية.

هذا هو مجالنا الرئيسي الشامل. ويتجسد هذا العمل في تطبيقات الموائع الدقيقة للتشخيصات التي تستخدم لمرة واحدة. لذا، فإن ما نصنعه في المختبر هو أجهزة الموائع الدقيقة.

في المواد thermoplastic، لا نستخدم عادةً PDMS، وهي المادة المطاطية التي يستخدمها معظم الأشخاص لصناعة أنظمة الموائع الدقيقة في المختبر. نحن نصنع أجهزتنا من المواد thermoplastic. ونهتم باستخدام هذه الأجهزة thermoplastic لإجراء البيولوجيا الجزيئية على المقياس الدقيق بطريقة تسمح بإجراء تلك البيولوجيا الجزيئية ميدانياً، بعيداً عن المختبرات المركزية.

أما كيفية تطبيق ذلك في المختبر، فهي تتمثل في قيامنا بتصنيع بطاقات بلاستيكية صغيرة تحتوي بداخلها على أعمدة لاستخلاص الطور الصلب، أو أعمدة لتحلل الخلايا، أو أعمدة للخلط. كما نجري تفاعل البوليميراز المتسلسل على الرقاقة كتقنية للكشف. وتُدمج كل هذه المكونات في جهاز صغير، والذي يهدف البحث في رؤيته طويلة المدى إلى تحويله في النهاية إلى جهاز متكامل يمكن حمله واستخدامه ميدانياً أو في بيئات لا تتوفر فيها مختبرات واسعة النطاق بما تتطلبه من أجهزة طرد مركزي وحاضنات حرارية وغيرها.

لذا، نود أن نتمكن بشكل مثالي من البدء بعينة بشرية مثل الدم أو البول أو البراز، أو مسحة من البلعوم الأنفي على سبيل المثال، والتي ستكون عبارة عن مخاط. ومن ثم، نحصل عند مخرج الشريحة على إجابة بنعم أو لا، حول ما إذا كان الشخص مصاباً بكائن حي دقيق معين. والطريقة التي نفعل بها ذلك هي من خلال البحث عن الـ DNA أو الـ RNA الخاص بذلك الكائن الحي الدقيق، اعتماداً على نوع الكائن، في عينة المريض.

لذا، تكمن التحديات التقنية التي تظهر إلى حد كبير في جانب تحضير العينة من تلك المعادلة. فعندما تبدأ بالدم أو البراز أو البول، يتعين عليك الانتقال من حالة يكون فيها لديك عينة بشرية غير نقية تحتوي على الكثير من الجسيمات المحتملة أو مثبطات تفاعل PCR أو تقنيات التضخيم الأخرى. وتريد في النهاية الحصول على عينة منقاة ومستخلصة من الأحماض النووية، والتي يمكنك استخدامها بعد ذلك لتضخيم أو البحث عن DNA أو RNA معين يخبرك ما إذا كان الكائن الحي الدقيق الذي تبحث عنه موجودًا.

لذا، ومن أجل تنقية هذه العينات، يتعين عليك القيام ببعض الخطوات. أولاً، يجب تصفية العينة، وهو أمر قد يتضمن -اعتماداً على العينة- تصفية خشنة أو خطوة طرد مركزي سريعة قبل وضع العينة على الشريحة. لذا، نحن نحاول دائماً البدء بالعينات كما تصل إلينا من الطبيب السريري.

لذا، فيما يتعلق بعينات البول والبراز ومسحات البلعوم الأنفي، هدفنا هو أن يقوم الطبيب بعمله كالمعتاد وأخذ العينة بالطريقة التي يتبعها عادةً. ومن ثم، نقوم بأخذ تلك العينة ووضعها على الرقائق. وبناءً على ذلك، إذا كانت هناك حاجة لإجراء المزيد من عمليات الترشيح في هذه الخطوة، فإن ذلك الترشيح سيحدث داخل الرقاقة.

تتضمن الخطوة الثانية، وبما أننا نجري مقاييس جزيئية، ضرورة تحلل الخلايا والكائنات الدقيقة الموجودة في تلك العينة. لذا نقوم بعد ذلك بخطوة تحلل، والتي تتضمن عادةً دفع العينة عبر مرشح ذي حجم مسام صغير. وأحياناً يحتوي هذا المرشح أيضاً على جسيمات نانوية مثل أنابيب الكربون النانوية، التي تمتلك حوافاً حادة يمكن استخدامها لتمزيق بعض الكائنات التي تمتلك جدران خلوية أكثر متانة مثل C difficile، وهي بكتيريا موجبة الجرام نتعامل معها، ويصعب تحللها للغاية.

لذا، يتعين علينا توفير أعمدة تحلل أكثر قوة. ولكن عادةً ما نقوم بعملية تحلل كيميائية وميكانيكية مشتركة داخل الرقاقة. بعد ذلك، يكون هدفنا هو أخذ ناتج التحلل ثم استخلاص الأحماض النووية المنقاة.

لذا، نقوم بتمرير ناتج التحلل عبر عمود استخلاص بالطور الصلب مدمج في الرقاقة الموائع الدقيقة. وهذا العمود المخصص للاستخلاص بالطور الصلب مصنوع من البلاستيك، وقد تم تصنيعه باستخدام كيمياء مُحفزة ضوئيًا داخل قناة الموائع الدقيقة بعد الانتهاء من تصنيعها. كما أنه يكون مُشبعًا عادةً بجسيمات السيليكا لأننا نرغب في ربط الأحماض النووية وتحريرها.

في بعض الحالات، قمنا بدمج حبيبات oligo DT إذا أردنا ربط وتحرير mRNA على وجه التحديد، على سبيل المثال، أو حبيبات تحتوي على أجسام مضادة معينة، إذا أردنا ربط وتحرير بروتينات محددة. ويمكننا تصنيع أعمدة استخلاص تقوم بكل هذه المهام. ولكننا سنعرض لكم اليوم كيفية تصنيع عمود استخلاص sase باستخدام حبيبات السيليكا.

بعد إتمام ذلك، يتم تمرير المستخلص الخلوي عبر عمود السيليكا، وهو يعمل تماماً كما تعمل أطقم kyogen في المختبرات ذات النطاق الواسع. ثم نقوم بعملية الغسل للتخلص من جميع المكونات الأخرى غير المرغوب فيها، مثل جميع الكربوهيدرات والليبيدات والمواد الأخرى الموجودة في المستخلص الخلوي وفي بقية العينة البشرية التي لا نحتاجها. وفي النهاية، نقوم بعملية الشطف باستخدام الماء.

والمميز في أعمدة الاستخلاص بالطور الصلب ذات المقياس الميكروي هذه هو أنه يمكننا إجراء الشطف بكمية صغيرة جداً من الماء، عادة ما تكون في حدود 1 إلى 5 µL. ونستعيد بذلك جميع الأحماض النووية التي وضعناها تقريباً؛ حيث تبلغ نسبة الكفاءة لدينا حوالي 70 إلى 90% في أول 10 µL نستعيدها من تلك القناة.

لذا، إذا قمنا بالغسل مرتين باستخدام 2 إلى 10 µL، فإننا نستعيد جميع الأحماض النووية التي وضعناها هناك تقريبًا. وبذلك، لا نحصل فقط على عينة نظيفة صالحة لتفاعل PCR، بل نحصل أيضًا على عينة ذات تركيز أعلى بكثير مما يمكن الحصول عليه باستخدام المجموعات المخبرية القياسية. لذا فإن الهدف النهائي من جميع تقنيات تحضير العينات هذه هو جعل النتائج متوافقة مع بعض الأعمال الأخرى التي أجراها الباحثون.

عمل رائع جداً في هذا المجال يوضح إمكانية إجراء تضخيم PCR على شريحة. يمكنك أيضاً إجراء تفاعل النسخ العكسي على شريحة إذا كنت تتعامل مع فيروس RNA أو إذا كنت ترغب في إجراء تجربة للتعبير الجيني. كما يمكن ربط تقنيات تحضير العينات لدينا مباشرة بـ PCR على الشريحة، وبذلك لن تضطر إلى القيام بأي من عمليات التنقية وتحضير العينات على طاولة المختبر.

بالإضافة إلى ذلك، هناك خطوة التركيز التي ستحتاج إلى القيام بها من أجل الحصول على الأحجام الضئيلة اللازمة لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المتعدد على شريحة صغيرة. لذا، فإن التجارب التي سنعرضها لكم اليوم توضح كيفية تجميع الشريحة الموائع دقيقة، والمصنوعة من اللدائن الحرارية وليس من مادة PDMS؛ وهو ما يتطلب عملية تصنيع مختلفة قليلاً عن تلك المستخدمة عادةً، وكيفية ختم هذه الشرائح.

ثم سنوضح كيفية إجراء الكيمياء المحفزة بالضوء داخل الشريحة لتكوين المونوليثات البوليمرية التي تُستخدم لكل من تحلل الخلايا والاستخلاص بالطور الصلب. وفي نهاية هذه العملية، والتي تعد حالياً عمليات نمطية في المختبر ولكن يمكن دمجها وقد دُمجت بالفعل، سنحصل في النهاية على عينة عالية التركيز من الأحماض النووية، RNA و DNA في الماء، والتي يمكنها الانتقال بعد ذلك إلى وحدة PCR أو وحدة تضخيم أخرى حيث يمكن تحديد نوع الكائن الحي الدقيق أو العدوى. في الواقع، لدينا منحة نعمل عليها حالياً حيث بدأنا في جمع عينات بشرية من مركز بوسطن الطبي من مرضى قد يكونون مصابين أو غير مصابين بإنفلونزا A. وبما أننا في موسم الإنفلونزا، فإن هذه هي العينات التي نقوم بجمعها.

وبعد ذلك في المختبر، نقوم بإجراء المقايسات المعيارية الذهبية للتحقق مما إذا كان الشخص مصاباً بإنفلونزا A، وهي أساساً مقايسة استنبات تتطلب عدة أيام للتنفيذ. وبالتوازي مع ذلك، نقوم بتمرير هذه العينات عبر وحدات الرقاقة الحالية؛ حيث نمررها عبر عمود التحلل، ثم عبر عمود الاستخلاص بالطور الصلب، وبعد ذلك نقوم بإجراء تفاعل PCR لمعرفة مدى كفاءة أدائنا مقارنة بالطرق المعيارية الذهبية.

هذه هي المرحلة التي وصلنا إليها حالياً. وإذا نجحت تلك التجارب، أعتقد أننا قد نصل خلال السنوات الأربع إلى الست القادمة إلى وضع يتوفر فيه شريحة متكاملة ومقايسة كاملة لفيروس influenza A، كما أننا نعمل أيضاً على clostridium difficile وعينات البراز. ونحن قريبون جداً ليس فقط من دمج الجهاز، بل وأيضاً دمج المقايسة.

لذا، يجب أن يتم تطوير المقايسة وتصميم الشريحة جنباً إلى جنب. وبالنسبة لتطبيق معين يهدف للوصول إلى مرحلة رعاية المرضى، فإنها عملية موجهة نحو الهدف حقاً؛ إذ يتعين عليك معرفة العينة التي تبدأ بها والكائن الحي الدقيق الذي تبحث عنه من أجل تحسين الشريحة لتكون مناسبة للاستخدام عند سرير المريض.

لذا، لا أعتقد أننا بعيدون جداً عن تحقيق ذلك في شكل نموذج أولي. هذه هي أهدافنا النهائية، لذا آمل أن نصل إليها.