بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

أهلاً ومرحباً بكم في مجموعة بيولوجيا الغشاء البنيوية والوظيفية. اسمي مارتن كافيري. يركز بحثنا على الغشاء البيولوجي، والذي يظهر مخططه في الشريحة الأولى؛ هذا الغشاء الذي يحيط بالخلية والعضيات تحت الخلوية عند وجودها هو عبارة عن بنية رقيقة جزيئياً، تتكون من جزيئين فقط من الدهون ومرصعة بالبروتينات.

نحن مهتمون بالبنية والوظائف المطبقة على كل من الليبيدات والبروتينات. ومع ذلك، ولأغراض هذه السلسلة من JoVE، سأقصر تركيزي على بروتينات الغشاء. نحن نسعى لفهم كيفية عمل بروتينات الغشاء هذه على المستوى الجزيئي لسببين.

أولاً، هناك الرضا الفكري الناجم عن معرفة كيفية عمل شيء ما. ثانياً، من خلال معرفة كيفية عمله، تماماً كما هو الحال مع دراجتك أو سيارتك، تبرز إمكانية إصلاحه في حال حدوث عطل ما. ويُعد تصميم الأدوية نتيجة بديهية لهذا النوع من العمل.

إن النهج الذي نتبعه لفهم كيفية عمل بروتين غشائي على المستوى الجزيئي هو تحديد بنيته البلورية. يتضمن ذلك تحديد موقع جميع الذرات في الفضاء ثلاثي الأبعاد، أو على الأقل جميع الذرات غير الهيدروجينية التي يتكون منها البروتين. وتُسمى الطريقة التي نستخدمها لهذا الغرض بـ حيود الأشعة السينية للجزيئات الكبيرة، واختصاراً MX.

نرى هنا مثالاً لبروتين غشائي تم تحديد بنيته باستخدام MX، حيث يتطلب الأمر بلورة من البروتين ذات جودة جزئية لإجراء الـ mx. وكما يمكنكم أن تتخيلوا، هناك العديد من الخطوات المتضمنة في تحديد البنية باستخدام علم البلورات الجزيئية الكبيرة كما هو موضح هنا. وتشمل هذه الخطوات عادةً تحديد بروتين غشائي مستهدف، ثم إنتاجه وتنقيتها وتبلوره.

تُجرى قياسات الحيود على البلورة باستخدام مصدر أشعة سينية منزلي أو مصدر سينكروترون. وتتم معالجة بيانات الحيود، مما ينتج عنه خريطة كثافة إلكترونية، يتم بعد ذلك مطابقتها مع نموذج جزيئي. وعند تنقية هذا النموذج، يمكن استخدامه لاستكشاف آلية عمل البروتين وفي تصميم الأدوية القائم على البنية.

يركز مقال JoVE هذا على توضيح كيفية إنتاج بلورات عالية الجودة من البروتينات الغشائية باستخدام الأطوار الوسطية للدهون عبر ما يسمى بطريقة "في الوسط" (in meso). يتوفر استعراض حديث لهذه الطريقة ونطاق تطبيقها في المرجع الأول. أما البروتوكول التفصيلي الذي سنتبعه هنا فقد ورد وصفه في المرجع الثاني، ويظهر هنا مخطط تدفقي يلخص الخطوات المتبعة والوقت المطلوب لإعداد تجربة بلورة للبروتينات الغشائية بطريقة "في الوسط".

يغطي هذا الفيديو الخطوات المحاطة بخطوط حمراء متقطعة. وتظهر هنا العناصر التي ستحتاج إلى القيام بها في عملية التبلور المتوسط (meso crystallization) في الوضع اليدوي. وتشمل هذه العناصر محلولاً مركزاً من بروتين الغشاء المنقى والدهون لإنشاء الوسط المضيف، وعادةً ما يتم استخدام mono ole لجعل الدهون أكثر وضوحاً.

في هذا الفيديو، تم استخدام محاليل مرسبة بصبغة حمراء، وأجهزة تكرار (pipetting devices) للمياه النقية ورؤوس قابلة للرمي ومجموعة من محاقن Hamilton محكمة الغلق بالغاز، بعضها بإبر قابلة للإزالة، ووصلة ضيقة القطر تُستخدم لخلط محلول البروتين مع الليبيد لإنتاج الميزوسومات. وموزع متكرر من شركة Hamilton، وشرائح مجهرية زجاجية وأغطية شرائح. وشريط فاصل مزدوج الالتصاق ومثقب ومعالج بالسيليكون لإنشاء الآبار، وملاقط، وجليد مجروش، ومناديل ورقية، وآلة حاسبة، والأهم من ذلك كله دفتر ملاحظات المختبر الخاص بك.

يُستخدم الإجراء التالي لتحضير شريحة تبلور زجاجية مزدوجة (glass sandwich crystallization plate). للبدء، ضع شريحة مجهرية مطلية بالسيليكون على طاولة المختبر. قم بإزالة الغطاء الورقي الواقي من أحد سطحي شريط لاصق مزدوج الوجه مثقوب يُستخدم كفاصل.

ضع الشريط بحيث يكون الجانب اللاصق ملامساً لسطح الشريحة مع الضغط. قم بتثبيت الشريط بإحكام على الشريحة. باستخدام بكرة أو أسطوانة، يمكن وضع رقاقة ألومنيوم بين الشريط والأسطوانة لحماية قاعدة الآبار.

قم بإزالة غطاء الورق الثاني من الشريط للكشف عن سطحه العلوي اللاصق. تُنتج هذه العملية شريحة زجاجية جاهزة للتحميل والختم اللاحق؛ وبمجرد اكتمال عملية التحميل، ضع أغطية شرائح ميكروسكوبية فردية مسلسلة بالقرب من الشريحة لختم الآبار بشكل سريع وفعال.

ضع الليبيد في كتلة تحكم حراري عند 45 درجة Celsius لمدة ثلاث دقائق حتى ينصهر. لاحظ أن الليبيد المستخدم عادة ما يكون mono land. في هذا الفيديو، تمت إضافة صبغة حمراء إلى الليبيد لزيادة الرؤية أثناء انصهاره.

قم بتحضير محقنتين من نوع Hamilton بسعة 100 microliter محكمتي الغلق لاستخدامهما في خطوة خلط البروتين بالليبيدات، وقم بإزالة زيت التفلون من المحقنة التي ستحتوي على محلول البروتين. ضع المحقنة التي ستحتوي على الليبيدات بجانبها، وفي هذه الحالة، يُترك الزيت في مكانه.

ضع قارن الأنبوب الضيق بين الحقنتين، ثم قم بتوصيل القارن بإصبع حقنة الدهون. أحكم ربط القارن بالحقنة، ولكن تجنب الإفراط في الربط. قم بإزالة المكبس من أسطوانة حقنة الدهون.

تأكد من أن الليبيد في حالة انصهار. اضبط الماصة على 30 microliters واسحب ببطء 30 microliters من غطاء الليبيد المنصهر. قارورة الليبيد.

يجب تخزين الدهون تحت غاز النيتروجين أو الأرجون عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. يتم سحب أكبر كمية ممكنة من الدهون المصهورة ببطء إلى الطرف المفتوح من المحقنة، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هوائية.

ضع المكبس داخل الأسطوانة بحيث يلامس الليبيد المنصهر، ثم ادفع المكبس ببطء إلى أعلى الأسطوانة مع إمساك المحقنة بشكل عمودي. وكما هو موضح، فإن فقاعة الهواء التي قد تُحبس عن غير قصد ترتفع أثناء هذه العملية ويتم تحريرها. لدينا الآن سدادة من الليبيد المنصهر في الأسطوانة، والتي يجب عليك تحديد حجمها بدقة.

يمكن القيام بذلك من خلال قراءة العلامات الموجودة على أسطوانة المحقنة. في هذه الحالة، يبلغ الحجم 23 microliters، والذي يتم تدوينه في دفتر ملاحظات المختبر. قم بتمرير الفراء فوق الإبرة الممتدة من الوصلة.

استخدم المكبس لدفع الليبيد المنصهر إلى أعلى الأسطوانة، ثم ببطء ورفق داخل الإبرة الموجودة في مركز الوصلة. إذا امتلأت الإبرة بشكل زائد قليلاً، سيظهر الليبيد وهو يتدفق من طرفها المفتوح. ومن خلال سحب المكبس للخلف قليلاً، يمكن سحب الليبيد الزائد إلى داخل الوصلة حتى يصبح بمحاذاة طرف إبرة الوصلة تماماً.

في هذه الحالة، تكون وحدة وصل المحقنة محملة بالكامل وجاهزة للدمج مع محقنة البروتين. يجب طرد المحلول مركزياً عند 14,000 G لمدة 10 min، ومن خمس إلى 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لإزالة التجمعات الكبيرة. قبل إعداد تجارب البلورة، أخرج محلول البروتين من دلو الثلج واتركه ليتوازن عند درجة حرارة الغرفة.

احسب حجم محلول البروتين الذي يجب استخدامه لتشكيل الطور المكعب عند أو بالقرب من التشبع المائي الكامل لـ olean عند درجة حرارة 20 درجة مئوية. يحدث التشبع المائي الكامل بالماء عند نسبة تقارب 40% بالوزن من الماء كما هو موضح في مخطط الطور. تذكر أننا ملأنا سرنجة الدهون بـ 23 من mono بكثافة 0.94 milligrams per microliter.

يعادل هذا 21.6 milligrams من الدهون، وبالتالي فإن 21.6 مضروبة في أربعة مقسومة على ستة أو 14.4 milligrams أو 14.4 µL من محلول البروتين هي الكمية المطلوبة؛ وباستخدام سرنجة Hamilton بسعة 25 أو 50 µL، اسحب الحجم المطلوب من محلول البروتين، وانقل المحلول إلى طرف التفلون الخاص بالمكبس في أسطوانة محلول البروتين. مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء، اسحب الإبرة بعناية وقس حجم محلول البروتين في السرنجة، حيث يجب أن يتطابق مع القيمة التي تم تحديدها في الخطوة السابقة.

استعداداً لدمجها مع السرنجة المحملة بالليبيدات، قم بتحريك محلول البروتين ببطء شديد إلى أعلى الأسطوانة حتى يصبح بمحاذاة نهايتها المفتوحة. يمكن ملاحظة ذلك من خلال النظر عبر الطرف النهائي للأسطوانة.

أصبح محلول بروتين lipin والمحاقن المملوءة جاهزة الآن للدمج؛ وللقيام بذلك، يتم ربط محقنة البروتين في الطرف المفتوح من الوصلة المتصلة بمحقنة الليبيد. بعد دمج المحقنتين بواسطة الوصلة، يجب أن يتشكل حجم مستمر من السائل يمتد من الليبيد في إحدى المحقنتين عبر الوصلة وصولاً إلى محلول البروتين في المحقنة الأخرى.

استعداداً لعملية الخلط، تُمسك الوحدة المجمعة بحيث تكون إحدى السرنجات في اليد اليمنى والأخرى في اليد اليسرى. يتم تسليط عزم دوران على كلتا الأسطوانتين وصولاً إلى الوصلة، باستخدام أصابع وإبهام كلتا اليدين لضمان بقاء الختم محكماً مقابل الأخاديد الموجودة في الوصلة أثناء عملية الربط. إن أي تلف في جهاز الخلط المجمع في هذه المرحلة سيؤدي إلى إتلاف ALS وتسبب التسريب، كما أن الربط المفرط سيؤدي أيضاً إلى حدوث تسريب.

إن الأمر مسألة خبرة تتضمن حتماً تجربة وخطأ وفقدانًا عرضيًا للعينات. ولذلك، يجدر التدرب باستخدام الدهون والماء أو محلول منظم لاكتساب الشعور بكيفية عمل النظام قبل البدء في استخدام محلول بروتيني قيم؛ ولإتمام عملية الخلط، ادفع المكبس في جانب البروتين من وحدة الخلط المجمعة إلى أقصى حده باستخدام الإبهام أو السبابة، مما يؤدي إلى دفع المحلول البروتيني من سرنجة البروتين عبر الوصلة إلى سرنجة الدهون. وإذا كانت الوحدة قد أُحكم إغلاقها بفعالية، فإن هذا الإجراء سيؤدي إلى حركة مساوية ومعاكسة للمكبس في جانب الدهون.

يُستخدم المكبس الموجود في جانب الدهون الآن لدفع محتويات حقنة الدهون مرة أخرى عبر المبرد وإلى حقنة البروتين. تكرر هذه العملية عدة مرات، وقد يتطلب الأمر أحيانًا مائة تمريرة أو أكثر لإنتاج طور ميسيل متجانس.

في بداية عملية الخلط، قد تكون حركة المواد ذهاباً وإياباً عبر الوصلة غير منتظمة، وقد يتطلب الأمر في بعض الأحيان بذل قوة إضافية لإتمام عملية الخلط، وهذا أمر متوقع. وعادةً ما يصاحب الخلط الأولي ظهور عكارة غير متجانسة في العينة، وهو أمر متوقع أيضاً.

مع تقدم عملية التجانس، يصبح الملمس -الذي يتم استشعاره من خلال القوة المطلوبة لتحريك المكبس ذهاباً وإياباً- أكثر تجانساً وتميزاً للمرحلة المكعبة اللزجة، وكذلك المظهر المرئي للمرحلة المكعبة الناشئة. وإذا كانت الظروف مناسبة وتكونت المرحلة المكعبة، فيجب أن يظهر التشتت شفافاً بصرياً داخل أسطوانة المحقنة.

وبذلك، يجب أن تكون العلامات الموجودة على أسطوانة المحقنة واضحة ويمكن قراءتها بسهولة من خلال الطور المتوسط الموجود في الأسطوانة. وفي حالة البروتينات الملونة، سيكون للطور المتوسط لون البروتين، ولكنه سيكون شفافاً بصرياً. ويمكن أن يؤدي التبريد الطفيف جداً للعينة أثناء الخلط، عن طريق وضع خلاط المحقنة على الثلج لفترة قصيرة، إلى تسريع التجانس وتحقيق الشفافية.

ومع ذلك، من المهم عدم المبالغة في خلط العينة، ويجب توخي الحذر لتجنب الخلط العنيف للغاية لأن ذلك قد يؤدي إلى ارتفاع درجة حرارة العينة بسبب التسخين الناتج عن الاحتكاك. في هذه المرحلة، تكون طور الميزا المكعب قد تشكل، وأعيد دمج البروتين في الطبقة الدهنية. أصبح طور الميزا الآن جاهزاً للتوزيع في الآبار الفردية لأطباق البلورة.

أولاً، ومع ذلك، يجب نقل الطور المتوسط إلى حقنة هاميلتون سعة 10 microliter مثبتة على موزع متكرر. ابدأ هذه العملية بتوصيل الحقنة بالموزع. قم بتعبئة الحقنة بالطور المكعبي.

قم بإزالة الإبرة والمكبس من المحقنة. اترك صمام التفلون في مكانه. قم بإزالة صامولة التثبيت من الموزع باستخدام عملة معدنية صغيرة.

مع سحب ذراع السقاطة بالكامل، أدخل السرنجة بدون المكبس والإبرة عبر حلقة تثبيت الموزع. أعد تركيب صامولة التثبيت بحيث يكون جانب الحشية مواجهاً للسرنجة، ثم اربطها بإحكام على الطرف المفتوح من السرنجة.

يجب توخي الحذر لضمان تمركز المحقنة بشكل صحيح في حلقة التثبيت ومحاذاة الأسطوانة بشكل موازٍ لذراع السقاطة. ويمكن التحقق من هذين الأمرين بالنظر. يعد هذان المتطلبان مهمين لأنه إذا لم يتحرك المكبس بحرية، فسيزداد الضغط في محقنة المصدر أثناء التعبئة وقد يحدث تسرب. مرر المكبس عبر حلقة الإمساك مع فك صامولة الإمساك بضع دورات، ثم وجه المكبس إلى الطرف المفتوح من المحقنة.

اضغط على ذراع السقاطة بالكامل لتحريك المكبس إلى داخل الأسطوانة، وتأكد من تحركه بحرية وبشكل كامل داخلها. في حالة ارتخاء المسمار وقضيب التوجيه، أعد ربطهما ثم تحقق مجدداً من تحرك المكبس بحرية. الآن أصبحت سرنجة التوزيع جاهزة للتعبئة.

حرك المكبس الموجود على أحد جانبي وحدة الخلط المجمعة إلى علامة تدرج صفر ميكروليتر. لنقل الطور المتوسط إلى السرنجة الأخرى والوصلة، افصل السرنجة الفارغة مع بقاء UL في مكانه من وحدة الخلط، ثم قم فوراً بتوصيل السرنجة المملوءة مع الوصلة المثبتة بالنهاية المسننة لسرنجة التوزيع سعة 10 µL.

تعد درجة إحكام عملية التوصيل أمراً بالغ الأهمية. وكما ذكر سابقاً، يتم ملء محقنة التوزيع عن طريق الضغط على مكبس محقنة الـ 100 microliter بحيث تنتقل الطور المتوسط (meso phase) عبر الوصلة. إذا كان التوصيل محكماً وكان مكبس محقنة التوزيع يتحرك بحرية، فسيبدأ المكبس في التحرك في اتجاه حركة مكبس التحميل مع امتلاء محقنة التوزيع.

افصل سرنجة التحميل المزودة بالموصل عن سرنجة التوزيع. قم بتثبيت إبرة قصيرة ذات طرف مسطح في النهاية الفولاذية لسرنجة التوزيع وأحكم ربطها بعناية في مكانها. ثبّت المكبس بذراع الترس عن طريق شد العقدة الموجودة في حلقة الإمساك.

يجب توخي الحذر لعدم شد العقدة بشكل مفرط، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى خدش المكبس وتشويهه مما يجعله غير قابل للاستخدام. ومن المهم ألا يتجاوز نطاق حركة ذراع السقاطة في حالة التثبيت بوصة واحدة.

وكما هو موضح فيما يتجاوز ذلك، سيميل المكبس إلى الانثناء وقد تفشل عملية التوصيل. اضغط على أسطوانة السقاطة عدة مرات لدفع المكبس داخل البرميل، وبذلك يتم ملء الحجم الفارغ للإبرة وتحميلها. يجب تكرار هذه الخطوة حتى 10 مرات إلى أن تخرج سلسلة مستمرة من طور الميزا (mesa phase) من طرف الإبرة.

أصبحت الإبرة الآن جاهزة للاستخدام في إعداد تجارب البلورة، والتي يجب أن تبدأ على الفور. لا ينصح بالاحتفاظ بالطور المكعبي المحمل بالبروتين لفترة طويلة قبل بدء تجارب البلورة. ونظراً لأن بعض البروتينات تكون غير مستقرة في الطور المكعبي بدون إضافة مادة مرسبة، ضع طبق بلورة متعدد الآبار وغطاء شريحة على سطح مرتفع ببضع بوصات فوق طاولة المختبر لتسهيل عملية التحميل.

يتم تحقيق التباين الأمثل والرؤية المحسنة عندما يكون السطح داكناً قليلاً. قم بتجانس محاليل المرسب وفك أغطية القوارير. اضبط مسبار توزيع المرسب على واحد µL مع إمساك سرنجة التوزيع رأسياً في يد واحدة، واستخدم اليد الحرة لتحديد موضع طرف الإبرة في المركز وفوق قاعدة البئر مباشرة.

رقم واحد. اضغط على الزر الموجود في الموزع المتكرر لطرد كتلة من mease على السطح الزجاجي. يبلغ حجم الكتلة 200 nanoliters.

عند استخدام الموزع المتكرر القياسي مع حقنة سعة 10 µL، يجب ألا يزيد ارتفاع طرف الإبرة عن بضع مئات من الـ µm فوق قاعدة البئر. ولضمان التوزيع السليم، يمكن تحقيق توزيع قابل للتكرار بسهولة، وهو أمر يتطلب فقط القليل من التدريب. بعد تعبئة الآبار الأربعة المتجاورة بـ mease، ضع 1 µL من محلول الترسيب فوق كل كتلة mease.

باستخدام ماصّة سعة 2 µL ورؤوس ماصّة قياسية ذات استخدام واحد وبأسرع وقت ممكن، ضع شريحة غطاء بشكل مستوٍ فوق الآبار المملوءة لتغطيتها بشكل موحد لضمان إحكام الغلق ومنع تسرب المياه. استخدم ملعقة مسطحة (spatula) لتسليط الضغط على شريحة الغطاء في نقاط تلامسها مع السطح اللاصق المكشوف لشريط التباعد. يمكن تكرار عملية توزيع المادة المترسبة والمادة الماصّة حتى يتم ملء وإغلاق جميع الآبار الموجودة في الطبق.

أصبح الطبق الآن جاهزاً للفحص والتحضين. قم بوضع ملصق تعريفي واضح على الطبق لأغراض التتبع. وعادةً ما يتم التعامل مع البروتينات الحساسة للضوء عن طريق تغليف الأطباق بورق الألومنيوم قبل وضعها في غرفة التحضين.

يمكن إزالة هذه الصفائح وفحصها تحت المجهر في ضوء خافت أو ضوء ملون مناسب. توضع الصفائح في غرفة ذات درجة حرارة مضبوطة، عادةً عند 20 درجة Celsius أو ما يقارب ذلك، وفق جدول زمني منتظم. يتم فحص الجدران للكشف عن نمو البلورات باستخدام مجهر الضوء المستقطب مع عدسة تكبير 10 أو 20 مرة.

الهدف، الجدول الزمني المستخدم في مختبر المؤلف هو كما يلي، الأيام 0 1 2 3 5 7 14 21 30 بعد التثبيت. افحص كتلة القياس بعناية. قم بضبط عمق التركيز ضمن العينة التي يبلغ سمكها 140 micron.

يجب إجراء الفحص في كل من الضوء العادي وبين مستقطبات متقاطعة؛ حيث تظهر بلورات بروتين الغشاء عديمة اللون التي تنمو في الطور المكعبي عند رؤيتها بالضوء العادي بهذا الشكل. بينما تظهر بلورات بروتين الغشاء عديمة اللون التي تنمو في meso عند رؤيتها بالضوء المستقطب بهذا الشكل أو ذاك، أما بروتينات الغشاء الملونة طبيعياً التي تنمو في meso فتظهر عند رؤيتها بالضوء العادي بهذا الشكل أو ذاك.

تتمثل الخطوات التالية في العملية الشاملة للتحديد البنيوي في حصاد البلورات وتبريدها بالتبريد العميق (cryo cool)، ثم تسجيل ومعالجة حيود الأشعة السينية منها. وتتم تغطية هذه المواضيع في مقالات JoVE منفصلة ضمن هذه السلسلة.