عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من أنسجة طحال الفأر
سبتمبر 20, 2024
هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل الإكسوسومات المشتقة من طحال الفأر باستخدام مزيج من الهضم مع الكولاجيناز من النوع الأول والطرد المركزي الفائق.
اجتذبت الإكسوسومات المشتقة من الأنسجة اهتماما متزايدا نظرا لقدرتها على عكس خصوصية الأنسجة والبيئة الدقيقة بدقة. ركز بحثنا على معرفة الأدوار الأساسية والانتقالية للإكسوسومات المشتقة من الطحال في أمراض القلب والأوعية الدموية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول عملي لعزل الإكسوسومات من أنسجة طحال الفئران ، مما يوفر تقنية قابلة للتكرار لتحليل التعريف اللاحق والدراسات الوظيفية.
نستخدم الكولاجيناز من النوع الأول للهضم ، متبوعا بالترشيح من خلال الطرد المركزي التفاضلي لإنتاج إكسوسوم الطحال عالي الجودة. على عكس التقارير السابقة ، باستخدام تجانس الأنسجة للحصول على تعليق الأنسجة ، يحافظ نهجنا على سلامة غشاء الخلايا في الأنسجة. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في دراسة دور الإكسوسوم في الاستجابات المناعية.
بالنظر إلى الوظيفة الحرجة للطحال في الجهاز المناعي ، يمكن للدراسات المستقبلية تكييف هذا البروتوكول مع الأنسجة البشرية ، مما يتيح استخراج الإكسوسوم ذي الصلة سريريا للأغراض التشخيصية والعلاجية. للبدء ، قم بتبريد أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة وفائقة السرعة مسبقا إلى أربع درجات مئوية واضبط درجة حرارة شاكر سطح المكتب على 37 درجة مئوية. تحضير أطباق زراعة الخلايا التي يبلغ قطرها 100 ملم.
بعد ذلك ، قم بترتيب 50 مل من أنابيب الطرد المركزي المعقمة والثلج ومصافي الخلايا المعقمة بقطر 70 ميكرومتر. رش 75٪ كحول لتعقيم المقص والملقط وتسخينها على درجة حرارة عالية لتعقيمها أكثر. بعد ذلك ، ضع أنسجة الطحال في طبق بتري معقم 100 ملم على الثلج واغسل الدم السطحي ب 1X PBS البارد.
جفف الطحال جيدا بشاش معقم قبل وزن الأنسجة. بعد ذلك ، باستخدام ماصة نقل معقمة ، أضف ملليلترا واحدا من PBS إلى مصفاة خلية 70 ميكرومتر لترطيبها. أخيرا ، قم بإعداد 0.1٪ كولاجيناز من النوع الأول في 1X PBS باستخدام خلاط دوامة للحصول على المخزن المؤقت للهضم.
للبدء ، قم بإعداد الكواشف والأدوات المعقمة لمعالجة الأنسجة. باستخدام المقص ، قم بتقطيع أنسجة الطحال إلى قطع صغيرة موحدة في طبق استزراع على الجليد وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر باستخدام ماصة نقل معقمة. بعد ذلك ، أضف عازلة الهضم إلى الأنبوب بناء على وزن أنسجة الطحال ، وقم بهز الأنبوب بزاوية 45 درجة على شاكر أفقي مضبوطة على 37 درجة مئوية.
أوقف عملية الهضم عندما تتشتت قطع الأنسجة وتفقد معظم القطع شكلها. انقل الخليط المهضوم من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة لإزالة بقايا الأنسجة الليفية والكبيرة. اجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.
قم بالطرد المركزي للمرشح عند 500 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وكرر خطوة الطرد المركزي بسرعات مناسبة. بعد الطرد المركزي الفائق ، تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات باستخدام PBS.
جهاز طرد مركزي فائق مرة أخرى عند 120،000 جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية لعزل الإكسوسومات. أخيرا ، قم بإذابة الإكسوسومات المعزولة في 200 ميكرولتر من PBS المعقم لكل طحال وتخزينها في أنبوب طرد مركزي سعة ملليلترين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. كشفت صور المجهر الإلكتروني للإرسال عن وجود حويصلات على شكل كوب مع طبقة ثنائية دهنية ، مميزة للإكسوسومات.
تراوحت أحجام الإكسوسوم من 30 إلى 150 نانومتر مع ذروة تركيز عند 60 نانومتر كما هو موضح في الرسم البياني لتوزيع الحجم. أكد تحليل اللطخة الغربية وجود علامات خارجية ، TSG101 و CD9 ، بينما لم يتم الكشف عن GM130 والتحكم السلبي.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً عملياً لعزل الإكسوزومات من أنسجة طحال الفأر، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم أدوارها في أمراض القلب والأوعية الدموية. تجمع هذه الطريقة بين الهضم باستخدام collagenase type I والطرد المركزي الفائق، مما يضمن الحصول على إنتاجية عالية الجودة من الإكسوزومات مع الحفاظ على سلامة الغشاء الخلوي.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث القلب والأوعية الدموية
خلفية علمية
- تعكس الإكسوسومات المشتقة من الأنسجة خصوصية النسيج والبيئة الدقيقة.
- تلعب الإكسوسومات المشتقة من الطحال دوراً في الاستجابات المناعية.
- يعد فهم وظيفة الإكسوسومات أمراً حيوياً لأبحاث أمراض القلب والأوعية الدموية.
- قد تؤدي الطرق السابقة إلى الإضرار بسلامة الغشاء.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول قابل للتكرار لعزل الإكسوسومات المشتقة من الطحال.
- تسهيل تحليلات التحديد والدراسات الوظيفية اللاحقة.
- تحسين فهم أدوار الإكسوسومات في أمراض القلب والأوعية الدموية.
الطرق المستخدمة
- هضم نسيج الطحال باستخدام collagenase type I.
- الترشيح عن طريق الطرد المركزي الفائق التفاضلي.
- عزل إكسوسومات عالية الجودة.
- الحفاظ على سلامة الغشاء الخلوي أثناء العملية.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للإكسوزومات المشتقة من الطحال.
- إكسوزومات عالية الجودة ومناسبة لمزيد من التحليل.
- تُظهر الطريقة تحسناً في الحفاظ على سلامة الغشاء.
- تطبيقات محتملة في دراسة الاستجابات المناعية.
الاستنتاجات
- يُعد البروتوكول الذي تم تطويره فعالاً لعزل الإكسوسومات من طحال الفئران.
- يمكن لهذه التقنية أن تعزز الأبحاث المتعلقة بوظائف الإكسوسومات في أمراض القلب والأوعية الدموية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة في تطبيقات متنوعة في علم المناعة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح العزل والتوصيف الموثوق للإكسوسومات المشتقة من الطحال تقليل المخاطر الميكانيكية والتحقق من الأهداف في أبحاث الأمراض المناعية وأمراض القلب والأوعية الدموية. ويدعم هذا البروتوكول الثقة التنبؤية من خلال الحفاظ على سلامة الإكسوسومات وضمان قابلية التكرار عبر سير عمل الاكتشاف والترجمة. كما تضع هذه الطريقة تحليل الإكسوسومات النوعية للأنسجة كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام في دراسات المؤشرات الحيوية والدراسات الوظيفية ضمن محافظ البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يمكّن من استقصاء مسارات التأشير التي تتوسطها الإكسوسومات في الأنسجة المناعية ذات الصلة بالمرض.
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال توفير ملفات تعريفية للحويصلات خارج الخلوية الخاصة بالأنسجة.
- يسهل التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال عزل الإكسوسومات بشكل قابل للتكرار وتأكيد المؤشرات.
الفحص وتطوير المقايسة
- يجهز عينات الإكسوزومات المعتمدة لإجراء المقايسات الكمية والنوعية اللاحقة.
- يوحد عملية عزل الإكسوزومات لضمان إمكانية تكرار نتائج فحص المؤشرات الحيوية والآليات الجزيئية.
- يتيح سير عمل قابل للتوسع لإجراء تحليل مقارن لمجموعات الإكسوزومات عبر ظروف مختلفة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يربط توصيف الإكسوسومات بنماذج مناعية وقلبية وعائية ذات صلة بالمرض.
- يدعم اكتشاف المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال عكس البيئة الدقيقة للأنسجة وخصوصيتها.
- يوفر استمرارية من مرحلة الاكتشاف المبكر إلى التحقق قبل السريري من الفرضيات القائمة على الإكسوسومات.
تكامل مسار العمل والتدفق
يتكامل هذا البروتوكول ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى الدراسات قبل السريرية، وذلك من خلال تمكين العزل القوي للإكسوسومات بغرض اختبار الفرضيات، وتحديد المؤشرات الحيوية، وإجراء الدراسات الميكانيكية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات حول التواصل بين الخلايا بوساطة الإكسوسومات والتعديل المناعي.
- الفحص: يوفر تحضيرات إكسوسومات قابلة للتكرار وموثقة بالمؤشرات لتطوير المقايسات وتقييم المركبات.
- التحليلات: يوفر بيانات كمية حول توزيع الحجم والتعبير عن المؤشرات لإجراء التحليلات المقارنة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بين الاكتشاف والأبحاث قبل السريرية من خلال تمكين دراسات الإكسوسومات الخاصة بأنسجة معينة ذات صلة بنماذج الأمراض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس بروتوكولاً موحداً وقابلاً للتطوير يمكن تكييفه مع أنواع الأنسجة الأخرى والبرامج البحثية المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في أبحاث الإكسوسومات.
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل معياري وقابل للتكرار والتوسع لعزل الإكسوسومات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف وكفاءة رأس المال من خلال تمكين دراسات قوية للمؤشرات الحيوية والآليات.
- التأثير على المحفظة: تدعم ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر وتعزيز برامج الاكتشاف القائمة على الإكسوسومات.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في معالجة الأنسجة، والطرد المركزي الفائق، وتحليلات الإكسوسومات.
- يتطلب الوصول إلى أجهزة طرد مركزي عالية السرعة وفائقة السرعة، والمجهر الإلكتروني، والبنية التحتية لتحليل لطخة وسترن (western blot).
- يستلزم توحيد معايير التعامل مع الأنسجة والبروتوكولات التحليلية بين الفرق المختلفة.
- قد يتطلب التكيف مع أنسجة أخرى تحسين معاملات الهضم والعزل.
- تعتمد كمية الناتج ونقاوته على جودة الأنسجة والتنفيذ الدقيق لخطوات البروتوكول.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Preparation of Equipment and Reagents for Spleen Tissue-Derived Exosome Isolation for Functional Analysis
3:00
Efficient Isolation of Exosomes from Mouse Spleen Using Collagenase Digestion for Biomarker Studies
4:50
Representative Results
